[发明专利]鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物及方法

说明书

本发明涉及生物毒株鉴别技术领域，具体公开了鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物及方法，提取待鉴别病毒DNA，采用本发明设计的引物进行第一步扩增，扩增出两条条带的为变异株或HB98疫苗毒株，扩增出1条条带的为经典毒株；扩增出两条条带的病毒DNA再进行第二步扩增，扩增产物分子量大小为211bp的为变异株,扩增产物分子量大小为293bp的为HB98疫苗毒株。第一步PCR的敏感度可以达到10TCID₅₀病毒量或0.01ng/ml质粒量，而第二步PCR敏感度达到10TCID₅₀病毒量或者0.1ng/ml质粒量。该敏感度可以有效的检测出临床病料中是否有伪狂犬病毒感染，并区分出伪狂犬病毒经典毒株或者变异毒株感染，并且准确率高。

技术领域

本发明涉及生物毒株鉴别技术领域，特别涉及鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物及检测方法。

背景技术

伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)是疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科的双股DNA病毒，基因组在140kd左右，编码69个开放阅读框。该病毒主要引起母猪流产、死胎及呼吸系统症状，仔猪出现神经症状和腹泻，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前，欧美洲很多国家通过免疫接种和净化技术已经根除该病。我国近十多年内通过采用强化免疫和净化技术，该病也得到有效控制。但是，2011年末，我国PRV疫苗免疫猪场再次暴发该病。全基因组分析结果也表明，此次新发的伪狂犬病病毒与之前的经典伪狂犬病毒属于不同的亚群，其抗原性发生了变化，变异毒株位于一个新的基因分支。因此建立PRV变异毒株和经典毒株鉴别方法十分必要。

目前现有的检测伪狂犬病毒感染的PCR方法有很多，其中最常用的两种是国标法与伪狂犬gE基因检测法。国标法主要针对伪狂犬病毒gD基因，可以特异的扩增出220bp的片段。因为gD基因是伪狂犬病毒感染过程中一个重要的囊膜蛋白，包括疫苗毒与野毒在内的各种类型的伪狂犬病毒(gD缺失的伪狂犬病毒除外)都存在该基因，所以该方法可以用于鉴别伪狂犬病毒的感染与否，但不能够区分疫苗毒与野毒株。而伪狂犬病毒gE基因检测法主要用于鉴别疫苗毒与野毒株，野毒株可以扩增出632bp的片段，而疫苗毒由于缺失了gE基因，所以不能扩增出相应的片段。因为现阶段猪场都有Bartha-K61等疫苗免疫，所以国标方法不再适合进行鉴别，而用于区分疫苗毒与野毒的伪狂犬病毒gE基因检测法得到了很好的应用，但是由于伪狂犬病毒变异毒株的出现，使这一方法受到了局限。该方法不能够区分出变异毒株与经典毒株，而变异毒株与经典毒株的区分在免疫与监测上又至关重要，所以需要一种可以有效区分伪狂犬病毒经典毒株与变异毒株的PCR诊断方法。

发明内容

为了有效的预控伪狂犬病的发生，区分出经典毒株与变异毒株的感染及其流行的区域至关重要。本研究通过不同毒力毒株全基因组序列比对，找到了经典毒株与变异毒株的基因差异区域UL44和UL36，设计PCR引物，建立了两步法PCR，具有较高特异性和敏感性，可用于鉴别PRV经典毒株与变异毒株，为该病诊断提供了有效方法。

本发明的技术方案包括以下内容：

用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物组，该PCR引物组包括引物1F-C、1F-V、1R、2F和2R，其中各引物的序列如下：

1F-C：5’-ACGCCGACCCCGAGTACTTTGACG-3’，

1F-V：5’-GAGCCCGTCTCGGGGACGAC-3’，

1R：5’-GGCCACGCGCACGGACACC-3’，

2F:5’-GATGCGGTCACCGTCGGGTTT-3’，

2R:5’-CCGCCGCTCAGCCCCCATCGT-3’。