[发明专利]一种滋养细胞、其制备方法及其在高效扩增NK细胞中的应用

说明书

本发明涉及一种滋养细胞、其制备方法及其在高效扩增NK细胞中的应用，该制备方法包括S1，pLenti‑mbIL21‑4.1BBL‑CD16A‑OX40L质粒载体的构建；S2，重组慢病毒的包装；S3，K562‑mbIL21‑4.1BBL‑CD16A‑OX40L滋养细胞的制备；S4，脐血或外周血白膜层细胞的制备；S5，NK细胞的体外扩增；本发明通过滋养细胞为NK细胞提供IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L等多个刺激分子来激活NK细胞，从而促使其体外大量增殖；NK细胞经过一个14天的增殖周期，能扩增10000倍以上，制得的NK细胞纯度能达到90％以上，相较于传统的表达IL21和4.1BBL滋养细胞刺激NK培养方法，本发明方法得到的NK细胞纯度，质量以及数量都有明显提高。

技术领域

本发明涉及基因工程和细胞生物学领域，具体涉及到一种能激活多个信号通路的滋养细胞、其制备方法及其在高效扩增NK细胞中的应用。

背景技术

NK细胞是一种先天性免疫细胞，它是病毒感染细胞和肿瘤细胞的天然杀手。与T细胞不同的是，NK细胞能通过其上的抑制受体KIR和NKG2A以及激活受体NKG2D、CD16以及NKp30来识别反常细胞，当靶细胞低水平表达抑制配体并且高水平表达激活配体时，就能导致NK细胞激活，释放穿孔素和颗粒酶来杀死靶细胞。

除了直接的抗肿瘤作用，NK细胞还能参与后天性的抗肿瘤反应，能起到免疫调解功能。

NK细胞主要在外周血中分布，一般成人的NK细胞占外周血单个核细胞的5％到10％，淋巴结和骨髓也有少量的NK细胞，而且大多数是处于静息状态。在NK细胞肿瘤免疫治疗中，往往需要很大数量的NK细胞才有比较好的治疗效果，因而，如何在体外高效扩增NK细胞是治疗癌症的关键所在。

目前，NK细胞的扩增方式主要有两种，一种是通过IL2、IL12、IL15、IL18、IL21等细胞因子来对NK细胞刺激扩增，这种方法的缺陷是成本较高，而且NK细胞增殖的倍数较少。另一种是通过滋养细胞刺激NK细胞增殖。目前最常用的滋养细胞是经过辐射的表达IL21和4.1BBL的K562细胞。对于NK细胞来说，IL21刺激能增强IFN-γ分泌、上调NK细胞穿孔素的分泌和表达、增强NK细胞毒功能，同时加速NK细胞的成熟和提高NK细胞激活受体的表达。4.1BBL也能调节NK细胞的激活信号传导。但这种方法也有扩增倍数不够理想，扩增的NK细胞CD56⁺CD16⁺双阳性比例低等缺陷。因而临床细胞免疫治疗急需一种更高效高质的NK细胞体外扩增方法。

人们现在知道治疗性抗体能明显提高NK细胞对肿瘤细胞的毒性，这种抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)是通过结合治疗性抗体的Fc部分到NK细胞的激活受体CD16，从而促使NK细胞激活。最近有人报道，通过OX40受体来激活NK细胞能增加NK细胞的IFN-γ分泌、细胞毒性以及增殖，OX40L是一个很好的提高NK细胞增殖的分子靶标。能否在K562稳定表达IL21和4.1BBL的基础上，同时表达NK细胞激活受体CD16的单链抗体CD16A和OX40的配体OX40L，利用这4种分子同时表达在K562细胞上，然后再作为滋养细胞来培养NK细胞，从而提高扩增的NK细胞的质量和数量是目前本领域亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的培养方法中NK细胞CD56⁺CD16⁺双阳性比例低、扩增倍数低等问题，本发明的目的在于提供一种能激活多个信号通路的滋养细胞、其制备方法及其在高效扩增NK细胞中的应用，利用IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L同时表达在K562细胞，并通过puromycin进行筛选，获得这4种分子同时高表达在细胞膜上的滋养细胞来培养NK细胞，最终获得高质量和高数量的体外扩增NK细胞。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。