[发明专利]一种支持HEK293细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种支持HEK293细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其制备方法和应用，属于细胞工程技术领域。本发明的无血清无蛋白培养基根据细胞体外生长的营养需求选择不同营养物质以替代动物血清所发挥的作用，并对不同营养物质的比例进行了合理调整，通过进一步添加抗剪切力物质和抗结团物质，实现了不需要补充血清也可以维持高密度悬浮培养HEK293细胞，并维持细胞的正常形态，使细胞分散不结团，同时保持正常的生长速度，利于目的基因的转染和表达。

技术领域

本发明涉及一种持HEK293细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基，以及该培养基的制备方法和应用，属于细胞工程技术领域。

背景技术

HEK293细胞是被广泛用于生产蛋白、疫苗、抗癌试剂及重组腺病毒包被的人源哺乳动物细胞系。细胞株最早于1976年由加拿大McMaster大学F.L.Graham与J.S.Miley用DNA转染技术构建而成。HEK293细胞是经5型腺病毒75株系转化、含有Ads E1区的人胚肾亚三倍体细胞系。HEK293细胞作为E1区缺陷互补细胞系，可持续表达ElA和E1B基因。HEK293细胞在培养体系中能够快速增长，经过适当的驯化可实现高密度悬浮培养，以用于大规模表达。

细胞培养基是决定细胞体外生长代谢最重要、最直接的环境因素。目前大多数合成细胞培养基均需要补充动物血清才能支持细胞的体外生长和增殖，而使用动物血清可能使培养物遭受动物性病原微生物污染和引入外源蛋白，给重组蛋白细胞产品的分离纯化带来很大困难。并且，HEK293细胞在悬浮培养过程中极易结团，细胞团直接影响细胞活性，导致HEK293细胞无法高密度扩增、连续传代。

现有技术中，进口品牌的HEK293悬浮培养无血清培养基配方保密且价格昂贵，还存在培养效果不佳、蛋白表达量低下和细胞结团等问题。公布号为CN109294976A的中国发明专利公开了一种支持HEK293细胞悬浮培养的无血清培养基，该培养基能维持HEK293细胞高密度悬浮培养，并维持正常的细胞形态，使细胞分散不结团，但是培养基中含有大量蛋白成分，如白蛋白、胰岛素以及转铁蛋白等，一方面增加了使用成本，另一方面不利于下游蛋白的纯化和生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种支持HEK293细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基，该培养基中未添加蛋白成分，有利于下游蛋白的分离纯化，并减少血清的外源病毒污染等潜在风险。

本发明还提供一种支持HEK293细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基的制备方法。

本发明还提供一种支持HEK293细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种支持HEK293细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基，包括氨基酸、微量元素、维生素、脂类物质、无机盐、抗结团物质和添加剂；所述抗结团物质的组成为：葡聚糖硫酸钠25～150mg/L，柠檬酸铁铵5～15mg/L；所述添加剂的组成为：腐胺0.1～1mg/L，胸腺嘧啶0.6～2.4mg/L，抗坏血酸磷酸酯镁1～5mg/L，乙醇胺1.5～12.5mg/L，金精三羧酸1～10mg/L，次黄嘌呤1～10mg/L，甲基-β-环糊精25～100mg/L，甜菜碱500～1000mg/L，牛磺酸60～180mg/L，海藻糖75～150mg/L，果糖500～1500mg/L，D-葡萄糖4000～8000mg/L，酵母水解物1000～3000mg/L，棉籽水解物1000～3000mg/L，Kolliphor p188 3000～6000mg/L。

本发明的无血清无蛋白培养基根据HEK293细胞生长需要的营养需求，由氨基酸、微量元素、维生素、脂类物质、无机盐、抗结团物质和添加剂等组成，培养基中不含动物源组分、不含蛋白，成分明确，不需要添加血清即可维持HEK293细胞的高密度悬浮培养。