[发明专利]一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体、制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一种特异性结合P‑糖蛋白的核酸适配体、制备方法及其应用，属于生物技术领域。所述核酸适配体的核苷酸序列选自序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14；是通过SELEX技术结合表面修饰的磁珠对原始随机寡核苷酸文库进行筛选、扩增、测序制备得到；所述核酸适配体分子量小，可以化学合成，成本低；亲和性和特异性强；便于标记；重复性和稳定性好，易于保存。可制作成荧光分子探针，实现生物体外组织、细胞上P‑gp的荧光可视化以及量化；可以特异性的结合P‑gp，抑制P‑gp的功能，成为P‑gp功能的潜在核酸型抑制剂。

技术领域

本发明涉及一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体、制备方法及其应用，属于核酸适配体技术领域。

背景技术

P-糖蛋白(P-gp)是由mdr 1基因编码的一种药物外排蛋白，在体内广泛分布于脑内毛细血管内皮细胞，肠道柱状上皮细胞，肝细胞面向胆小管的腔膜面等，与底物结合后将其从细胞浆中排出细胞，对药物在体内吸收、分布、代谢、排泄有重要的作用，它的底物广泛，其中包括黄酮类、查耳酮类、生物碱类、皂苷类等天然产物。研究表明P-gp的外排功能与肿瘤细胞的多药耐药性有关，寻找P-gp低毒、高效抑制剂成为抗肿瘤的有效策略之一。目前P-gp的经典抑制剂如维拉帕米、LY33597等，因其活性低、特异性差、细胞毒性高等缺陷，尚未广泛应用。

核酸适配体是利用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术筛选得到的能特异结合靶物质的寡核苷酸片段。SELEX技术是上世纪90年代由Tuerk和Ellington等人发明的一种新的组合化学技术。它利用分子生物学技术，构建人工合成的随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度一般在20～40nt左右，两端引物序列一般在20nt左右，文库容量大约在10¹⁴～10¹⁵范围内。由于单链寡核苷酸随机序列，尤其是RNA序列容易形成凸环、发卡、假节、G-四聚体等二级结构，故能与蛋白质、肽段、药物、氨基酸、有机化合物、甚至是金属离子相结合，形成具有很强结合力的复合体。SELEX技术具有经济、简便、快速等特点。与其他组合化学库如随机肽库、抗体库、噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸随机文库中筛选出的核酸适配体具有很多优势：(1)寡核苷酸本身分子量较小，易于合成，便于后续试验；(2)某些核酸适配体具有强于抗体的亲和性和特异性，无免疫原性；(3)核苷酸的化学结构和性质提供了易于标记的特性；(4)稳定性好，半衰期短，易于保存和运输，对高温和剧烈环境不敏感。(5)核酸适配体较于抗体易合成。因此，寡核苷酸核酸适配体在生物荧光可视化领域具有良好的应用前景，可以克服传统抗体在血液存在时间长，产生较高背景信号从而影响可视化效果的缺陷，可实现生物体外的组织、细胞水平上生物过程的可见、描述及定量。

目前，与P-gp具有高特异性和高亲和力的核酸适配体尚无相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体、制备方法及其应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸系列选自核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14的一种。

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体是与所述核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14中的一种序列一致性为60％以上，并且具有相同功能的核苷酸序列。

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体是与所述核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14的一种序列杂交，并且具有相同功能的寡核苷酸序列。

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体是与所述核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14的一种序列转录的RNA序列。