[发明专利]一种内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及其制备方法和应用

说明书

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种黄杆菌属来源的内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及其表达蛋白的制备方法和应用。本发明褐藻胶裂解酶AlgN15来源于黄杆菌属菌株，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示。所述内切褐藻胶裂解酶最适反应温度20℃，稳定性高，常温贮藏6个月，酶活性保持80％以上，对于PolyG具有较高底物偏好性，产物主要聚合度4‑6，占反应产物的60％。本发明将该新褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的褐藻胶裂解酶AlgN15，可在低温或常温下对海藻粗资源实现高效降解。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种黄杆菌属来源的内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及其表达蛋白的制备方法和应用。

背景技术

褐藻胶作为褐藻细胞壁的填充物质，是广泛存在于各种褐藻中的一类多糖物质，可占到藻体干重的20-40％。褐藻胶由α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic acid，简称G)和β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid，简称M)两种单体单元组成，其中G和M互为C5位的差向异构体，它们随机排列成褐藻胶分子的三种结构区：聚甘露糖醛酸片段[polymannuronate，poly(M)]，聚古洛糖醛酸片段[polyguluronate，poly(G)]以及MG交替嵌段[heteropolymeric M/G blocks，poly(MG)]。褐藻胶溶于水，黏度高，可应用于食品、医药、纺织等领域。

褐藻寡糖是褐藻胶的降解产物，分子量低，水溶性好，具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抑菌、促进作物生长等，在药物研制、功能食品及农用制剂研发等领域具有广阔的开发前景。研究发现褐藻寡糖的生物活性与其结构单元及聚合度密切相关，如Yamasaki等采用酸降解和酶降解两种方法制备的褐藻寡糖处理莱茵衣藻，发现酶法制备的褐藻寡糖以浓度依赖的方式显著促进莱茵衣藻生长，而酸水解制备的褐藻寡糖则没有表现出生物活性(Journal of Bioscience and Bioengineering,113(1):112-116)。研究人员比较了不饱和甘露糖醛酸和古罗糖醛酸对胡萝卜和水稻的根伸长活性。聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸没有活性，但酶解聚古罗糖醛酸产物有较好活性，而且进一步分析聚合度与活性关系，发现五聚物具有最好的促生长活性(Bioscience Biotechnology andBiochemistry,67(9):2022-2025)。最新在医药领域的研究表明：由寡M段褐藻胶寡糖制备的I类候选新药“GV971”能抑制β-淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，可用于治疗轻中度阿尔兹海默症，已经获批上市。这表明，特定聚合度的大小及M/G的比例的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，因此实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。

目前褐藻胶寡糖的制备方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法。其中化学降解法存在降解条件难以控制、产物质量不稳定的问题，物理降解法降解效率低，往往不能获得低聚合度的寡糖产品，相对而言，酶法降解具有降解条件温和，产物活性高等优点，而且由于酶法降解所具备的专一性特点，是实现特定聚合度的大小及M/G比例的褐藻胶寡糖生产的首选方法。