[发明专利]一种诱导型滋养层干细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种诱导型滋养层干细胞的制备方法，其特征在于，其包括采用细胞培养基将人多能干细胞培养为具有无限增殖和分化成亚型滋养层细胞的诱导型滋养层干细胞；

所述人多能干细胞包括人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞；

所述细胞培养基包括基础培养液，且所述细胞培养基中至少还含有以下组分：0.5～2.5μg/mL维生素C、20～70ng/mL表皮生长因子、1～5μM WNT通路激活剂、0.3～1.9μM TGF-β通路抑制剂、3～7μM ROCK通路抑制剂以及0.6～1.1mM组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

2.根据权利要求1所述的诱导型滋养层干细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞培养基中还包括以下一种或多种组分：0.5～1.5％胰岛素样转铁蛋白添加剂、0.05～0.15mMβ-巯基乙醇和0.1％～0.5％BSA；

优选地，所述细胞培养基还包括0.1～0.7％青链霉素混合液和/或0.1～0.4％FBS；

优选地，所述WNT通路的激活剂为CHIR99021；

优选地，所述ROCK通路抑制剂为Y-27632；

优选地，所述TGF-β通路抑制剂包括A83-01和/或SB431542；

优选地，所述TGF-β通路抑制剂包括A83-01和SB431542，在所述细胞培养基中，A83-01的终浓度为0.3～0.7μM，SB431542的终浓度为0.8～1.2μM；

优选地，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸钠；

优选地，所述基础培养液选自以下培养基中的至少一种：DMEM/F12、RPMI1640和HamsF-12。

3.根据权利要求2所述的诱导型滋养层干细胞的制备方法，其特征在于，所述亚型滋养层细胞包括绒毛外细胞滋养层细胞和/或合体滋养层细胞；

优选地，所述人胚胎干细胞包括H1 hESC和/或HN10 hESC；

优选地，所述诱导多能干细胞选自以下细胞中的至少一种：尿液细胞来源的iPS细胞UE005-iPS、绒毛外间充质细胞来源的iPS细胞hAMC-iPS、hAMC002-iPS以及hAMC004-iPS。

4.根据权利要求1～3任一项所述的诱导型滋养层干细胞的制备方法，其特征在于，采用细胞培养基培养时，人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞的接种密度为(1～9)×10⁵个cell/mL；

优选地，所述制备方法包括将制备得到的诱导型滋养层干细胞进行传代培养；

优选地，所述传代培养的细胞融合度为90～100％；

优选地，当细胞融合度达到90～100％时，所述传代培养包括采用消化酶与细胞共孵育，以获得细胞溶液，所述消化酶为0.3～0.7mM EDTA；

优选地，所述传代培养的比例为1：(2～4)；

优选地，所述传代培养的培养基为所述细胞培养基；

优选地，将人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞在所述细胞培养基中培养前，所述制备方法包括：将人胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞在干细胞培养基中36～38℃预培养22～26h；

优选地，所述干细胞培养基为mTeSR1培养基；

优选地，所述预培养在包被有Matrigel的培养皿中进行。

5.一种诱导型滋养层干细胞，其特征在于，其采用权利要求1～4任一项所述的诱导型滋养层干细胞的制备方法制得。

6.如权利要求5所述的诱导型滋养层干细胞在制备用于胎盘发育障碍相关性疾病的药物中的应用；

优选地，所述胎盘发育障碍相关性疾病包括以下疾病中的至少一种：子痫前期、子痫、胎盘植入和胎儿生长受限。

7.如权利要求5所述的诱导型滋养层干细胞在用于研究胎盘发育过程中的调控网络中的应用；

优选地，所述调控网络包括转录因子、胞外信号、表观遗传修饰、代谢及细胞周期中的至少一种。

8.如权利要求5所述的诱导型滋养层干细胞在用于模拟早期胚胎合成或胚胎干细胞自组装中的应用。