[发明专利]一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针及其制备方法和应用，其特征在于，通过HBTU/DIEA偶联反应，将羧基苯硼酸修饰到g‑C₃N₄上，后经超声剥离，可得到弱荧光的硼酸修饰的石墨相氮化碳纳米片(BCNNS)，再将抗体(Ab)标记到BCNNS上，可得到强荧光的Ab‑BCNNS复合材料(ON)，随着目标抗原的加入，Ab‑BCNNS复合材料的荧光发生猝灭现象(OFF)，基于这种ON‑OFF现象，即可实现对目标抗原的特异性检测；而且通过改变Ab‑BCNNS中的标记抗体，即可实现对不同目标抗原的选择性检测。

技术领域

本发明属于分析检验技术领域，涉及一种免疫检测方法，具体涉及一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针及其制备方法和应用。

背景技术

生物标志物一般是指可供客观测定和评价的生理、病理、治疗过程中的某种特征的生化指标。通过对生物标志物的测定能够获知机体当前所处生物学过程的进程。生物标志物的检查，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程的监控能够起到一定的帮助作用。

因此，寻找和发现有价值的生物标志物已经成为相关领域的研究热点，而在对生物标志物研究的过程中人们发现关键的问题是：如何提高对生物标志物检测的准确性。

在提高准确性的研究中，基于抗原-抗体特异性识别的免疫分析以其在复杂样品检测中的高灵敏、高选择性，已成功应用于各种生物标志物的检测。其中，酶联免疫吸附测定(ELISA)由于其良好的选择性和灵敏度、简单的操作手法、以及可外带测试等优势在临床分析、药物分析、毒物分析等领域得到了广泛应用。但是，ELISA检测过程中涉及到涂板、洗涤、封闭、孵育、检测等多个步骤，不仅劳动强度大、试剂用量多，而且耗时长，导致诊断延迟，所以应用结果较差。

因此，研究人员致力于开发更快速、更简单、更灵敏的免疫测定方法。例如，基于电化学(ECL)或表面等离子体共振(SPR)的免标记免疫分析法，基于ECL或SPR的竞争免疫分析法等。然而，这些新开发的方法通常需要复杂的化学反应机制，所以这些方法还需要进一步的改进和完善才能实现广泛应用。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针及其制备方法和应用，采用抗体(Ab)标记的BCNNS(Ab-BCNNS)为荧光探针，对目标抗原进行选择性检测，通过改变Ab-BCNNS中的标记抗体，可实现对不同目标抗原的选择性检测。

一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，所述荧光免疫探针的制备方法包括以下步骤：

(1)g-C₃N₄粉末的合成：将1-5g双氰胺于氧化铝坩埚中，盖上盖子并用铝箔纸包裹密封，放入马弗炉中，以3℃min^-1的速度升温至550℃并保持2h；待反应物冷却至室温取出，所得淡黄色固体即为g-C₃N₄，用玛瑙研钵将所述g-C₃N₄研磨成均匀固体粉末，备用；

(2)硼酸修饰：取4-羧基苯硼酸和HBTU于无水DMF中，搅拌使其溶解，并在50℃下继续搅拌30-60min，得到混合物；随后向所述混合物中加入所述g-C₃N₄和DIEA，50℃下继续搅拌12-16h完成反应；将反应后的产物离心收集，并依次用无水乙醇和二次水各清洗2-3次，60℃下烘干得BCN；

(3)用超声辅助液体剥离法将所述BCN剥离成BCN纳米片BCNNS：取所述BCN于锥形瓶中，加入二次水配成浓度为1mg mL^-1的悬浮液；之后连续超声10h；随后将超声所得奶白色悬浮液在3000rpm转速下离心15min，收集上清；将所述上清在14000rpm转速下离心10min，收集沉淀，即为BCNNS；将所述BCNNS冷冻干燥后称重，配成0.2mg mL^-1的BCNNS分散液，备用；