[发明专利]一种基于比色法检测生物样品中NAD+

权利要求书

1.一种用于检测生物样品中NAD⁺含量的反应液，其特征在于，所述反应液包含双苷肽、八肽胆囊收缩素、乙醇脱氢酶、烟酰胺和无水乙醇，其中各组分的浓度为：

双苷肽 50mmol/L～100mmol/L；

CCK-8 0.1ml/L～0.5ml/L；

乙醇脱氢酶 10单位/L～15单位/L；

烟酰胺 100mmol/L～150mmol/L；

无水乙醇 5％～10％。

2.如权利要求1所述的反应液，其特征在于，所述的反应液为每毫升包含820μL的61mmol/L pH7.4的双苷肽，100μL CCK-8，5μL 2.6千单位/mL乙醇脱氢酶，28.5μL的3.5mol/L烟酰胺，57μL无水乙醇。

3.一种用于检测NAD⁺含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1或2所述的反应液、样品裂解剂和pH中和剂。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述样品裂解剂为高氯酸，所述pH剂中和剂为碱性试剂，优选地，所述pH中和剂为KOH水溶液或NaOH水溶液。

5.一种基于比色法检测生物样品中NAD⁺含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将待测生物样品与权利要求1或2所述的反应液进行显色反应，显色稳定后在波长450nm处测定吸光值；

根据由若干个浓度梯度的NAD⁺标准品溶液建立的NAD⁺浓度与吸光值的标准曲线，计算得到待测生物样品中的NAD⁺含量。

6.如权利要求5所述的基于比色法检测生物样品中NAD⁺含量的方法，其特征在于，所述的待测生物样品在与反应液反应前先在裂解液中进行裂解处理，在裂解处理后将pH调节到中性，然后将中性混合液离心得到的上清液，再将所述上清液与反应液进行显色反应；优选地，所述的裂解液为高氯酸；更优选地，所述裂解液为浓度0.5mol/L高氯酸水溶液。

7.如权利要求5或6所述的基于比色法检测生物样品中NAD⁺含量的方法，其特征在于：

所述的待测生物样品选自细胞样品、血液样品或组织样品；

优选地，所述的血液包括外周血；

优选地，所述的组织样品选自脑、心脏、肌肉、脂肪、肝脏、脾脏、肾脏、骨髓、胸腺、肺中的一种。

8.根据权利要求7所述的基于比色法检测生物样品中NAD⁺含量的方法，其特征在于，

当所述的样品为细胞时，去除培养基后，加入高氯酸进行裂解；

当所述的样品为血液样品时，进行抗凝处理后，加入到高氯酸中裂解，至血液呈暗红棕色；

当所述的样品为组织样品时，将组织样品与高氯酸混合，进行低温研磨。

9.根据权利要求7所述的基于比色法检测生物样品中NAD⁺含量的方法，其特征在于：

当所述的样品为细胞时，按每2×10⁶细胞配比480μL高氯酸进行裂解；

当所述的样品为血液样品时，按每100μL以内的血液样品配比480μL高氯酸进行裂解；

当所述的样品为组织样品时，所述的高氯酸的用量为使组织样品被高氯酸完全浸没。

10.根据权利要求5所述的基于比色法检测生物样品中NAD⁺含量的方法，其特征在于，当所述的样品为组织样品时，所述的高氯酸按480μL高氯酸配比如下质量范围的组织样品进行裂解：

组织	取样质量范围
肝脏	7.5mg～8.5mg，
肌肉	9.5mg～10.5mg，
脂肪	30mg～35mg，
脑	9.5mg～10.5mg，
心脏	7.5mg～8.5mg，
脾脏	9.5mg～10.5mg，
肺	7.5mg～8.5mg，
肾脏	7.5mg～8.5mg，
胸腺	9.5mg～10.5mg

当所述的样品为血液样品时，按每40μL血液样品配比480μL高氯酸进行裂解。