[发明专利]一种分离提纯来自血浆的外泌体的方法和应用

说明书

本发明涉及一种分离提纯来自血浆的外泌体的方法，步骤如下：取人血浆离心后取上清；将离心后的血浆超速离心；离心后抽取上清；将上清离心、倾倒上清后倒置；待管内无可见液滴后，使用滤纸在管内壁进行擦拭；使用PBS反复吹打管底、重悬后注入PBS，混匀；过滤上述重悬液；使用PBS将过滤后的重悬液体积补充后加入超速离心管；离心、倾倒、倒置；待管内无可见液滴后，使用滤纸在管内壁进行擦拭；加入PBS或裂解液重悬管底的沉淀，得到外泌体。本发明方法结合了超速离心以及滤膜过滤的方法，操作简单，可以从较小量的血浆中提取外泌体，所提取的外泌体含量较多，可以用于一系列生物学实验。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其是一种分离提纯来自血浆的外泌体的方法和应用。

背景技术

细胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)是外泌体(exosomes)、微囊泡(microvesicle)和凋亡小体等细胞释放的带有膜结构小体的总称。其中外泌体是细胞分泌的直径在30-150nm之间的纳米级微囊泡。外泌体起源于细胞核内体，表面是双层脂质膜，富含来自母体细胞的蛋白、脂质、转运RNA和小RNA成分，是细胞间信号传导的重要媒介。双层脂质膜不仅可保护外泌体携带的成分长时间保持生物学活性，而且可使得外泌体携带大分子蛋白穿过血脑或血眼屏障。

外泌体由于有双层脂质膜的保护，其包裹的蛋白质和RNA成分可长时间保持稳定不被降解，因此外泌体中的蛋白较血浆蛋白稳定性更好。由于具有双层脂质膜结构，外泌体还可通过血脑、血眼生物学屏障。目前，外泌体已用于多种疾病的诊断和发病机制研究，例如，血清中携带磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的外泌体可作为早期胰腺癌诊断的生物学标记物；血浆外泌体中α突触核蛋白的表达水平可作为帕金森患者的生物学标记物，反映脑内疾病的严重程度。外泌体已经成为近几年生命科学领域研究热点，具有很大的学术及应用价值。

目前市场上的外泌体提取试剂盒，多数采用多聚物沉淀及密度梯度离心，但是提取的外泌体受聚合物影响，往往不纯。超速离心作为传统并有效地分离外泌体的方法仍在被绝大多数研究者使用。传统的超速离心方法，传统的超速离心方法对于中等大小囊泡的离心力为10000g-20000g，且未使用PVDF膜过滤，对其去除效果不佳，对于回收外泌体的离心力为110,000g，离心力不够，最终导致对外泌体的回收率极低，往往需要多个病例的血浆外泌体混合成一个样品进行分析，而临床样本的差异较大，混合样本可造成结果假阳性。另一方面，传统超速离心或试剂盒提取法常伴有血浆高丰度蛋白的污染，严重影响了下游实验的进行。所以，目前亟待一种获取纯度、浓度较高的外泌体的方法。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种分离提纯来自血浆的外泌体的方法和应用，该方法成本低廉，提取的外泌体纯度高，含量高，为科研提供了保障。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种分离提纯来自血浆的外泌体的方法，步骤如下：

⑴取人血浆，经2000g×15min离心后取上清；

⑵将离心后的血浆与PBS混合后进行超速离心；

⑶4℃，80000g×30min离心后抽取上清；

⑷将上清转移入新的超速离心管，4℃，110，000g×120min离心后，倾斜30-60度倾倒上清后，将管倒置放于滤纸上；

⑸待管内无可见液滴后，使用滤纸在管内壁进行擦拭，避免碰到管底；

⑹使用PBS反复吹打管底，轻柔重悬管底的沉淀，充分重悬后注入PBS，混匀；

⑺使用220μm的PVDF滤膜过滤上述重悬液；

⑻使用PBS将过滤后的重悬液体积补充后加入超速离心管；