[发明专利]过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法。巨噬细胞分离与激活，构建hACE2过表达载体，电转将hACE2过表达载体转进巨噬细胞，采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞，即得过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂。本发明首先确定了能够实现特异性、高效识别新冠状病毒和SARS病毒靶位点的人hACE2基因序列，而后通过质粒电转染的方法导入巨噬细胞，利用免疫磁珠筛选hACE2阳性细胞群及测序鉴定，获得过表达hACE2基因的巨噬细胞。本发明过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的生产，大大提升了巨噬细胞消除以hACE2为受体的病毒能力。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法。

背景技术

肾素-血管紧张素系统(rennin angiotensin system,RAS)在机体中发挥有重要的生物学作用，它可以通过对心血管、肾脏的调节而维持血压、体液和电解质的平衡。血管紧张素II(angiotensinII,AngII)在RAS系统中发挥着重要的病理生理学作用，八肽的AngII是由血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)将十肽的AngI水解2个羧基而产生。2000年Tipnis等发现了在RAS系统中发挥有重要生物学作用的血管紧张素转换酶2(ACE2)，ACE2与ACE的不同在于它是一种单羧基肽酶，可以水解AngII生成Ang(1-7)，Ang(1-7)具有其高度亲和力的Mas受体，Ang(1-7)与ACE2和Mas受体共同构成ACE2-Ang(1-7)-Mas轴，成为RAS系统里的另一重要的生物学作用途径，其中多项研究表明该途径可以对抗ACE-AngII-AT1R生物学轴所介导的多种心血管病理生理作用，如降血压、抗动脉粥样硬化和保护心脏功能等作用。

血管平滑肌细胞的增殖是高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病发病的病理学基础，国内外多项研究表明ACE2的过表达具有抗动脉粥样硬化、抗炎以及抗细胞增殖等心血管保护作用。ACE2的过表达可以通过下调AT1R和ERK1/2的磷酸化水平而抑制平滑肌细胞的增殖，表明ACE2具有血管保护作用。

虽然病毒入侵人体可能有多种不同方式，但通过呼吸道入侵肺部并引发重症肺炎仍是其致病最主要模式。人体肺脏是一个复杂的组织器官，包括二十三级的支气管分支和上亿的肺泡结构。

肺泡内又有I型、II型两类肺泡上皮细胞及伴行的血管内皮细胞，还有包括巨噬细胞在内的各种免疫细胞等。任何一类细胞理论上均可能成为冠状病毒感染的靶细胞。以往的免疫组织学研究已经对hACE2受体在人体肺组织内的表达情况进行了分析，结论显示hACE2在人体I型肺泡、II型肺泡、支气管上皮和血管内皮等多种细胞均有表达。

ACE2是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)的关键分子，也是包括肺泡上皮细胞在内的多种人体细胞表面表达的重要分子之一。2003年，hACE2被鉴定为SARS冠状病毒的功能性受体。hACE2分子也是ncov-2019病毒感染的关键分子，通过结合hACE2分子有可能影响ncov-2019病毒感染人体细胞的过程。

目前，亟需提供一种可以与新冠状病毒、SARS病毒等各种病毒结合，进而杀死病毒，提高对病毒的清除效率的过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法，制得的过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂能让巨噬细胞更精准的与包括新冠状病毒、SARS病毒在内的可以与hACE2蛋白结合的各种病毒进行结合，进而杀死病毒，大大提高对病毒的清除效率。

本发明所述的过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)巨噬细胞分离与激活

巨噬细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；