[发明专利]一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达及应用

说明书

本发明提供了一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达及应用,并公开了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列及其酶学性质,属于生物工程技术领域。色氨酸脱羧酶OpTDC2可用于催化色氨酸脱羧形成色胺，其米氏常数K_m值为1.02mM。相比于其他植物来源的色氨酸脱羧酶，比如长春花(Catharanthus roseus)K_m为1.31mM，萝芙木(Rauvolfia verticillate)K_m为2.89mM，印度人参(Withania Somnifera)K_m为1.49mM，我们的色氨酸脱羧酶OpTDC2具有更低的米氏常数，即对底物的亲和力更强，催化效率更高，可以为合成生物学研究提供多样性的底物来源，因此具有一定的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达及应用，并公开了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列、其酶学性质，属于生物工程技术领域。

背景技术

色氨酸脱羧酶(Tryptophan decarboxylase，EC 4.1.1.28,TDC)可以催化色氨酸脱羧形成色胺，是喜树碱合成过程中连接初生代谢和次生代谢的关键酶。

色氨酸脱羧酶最早是见于药用植物长春花中进行报道，并且在多种植物中均有发现。

色氨酸脱羧酶属于裂解酶类，具有较高的底物特异性，对类似的芳香族氨基酸如酪氨酸，苯丙氨酸等没有脱羧作用。

先前的研究表明，色氨酸脱羧酶基因在陆生植物中往往以多基因家族形式存在。例如，Melina等人于1997年在喜树中分离和鉴定了两条色氨酸脱羧酶基因；Pang等人对西红柿中全部5条色氨酸脱羧酶基因进行了功能解析；Kang等人通过生物信息的手段证明水稻中含有七条色氨酸脱羧酶基因及其类似物。

然而截止目前为止，短小蛇根草中的色氨酸脱羧酶见于报道的只有一条。这一现象与其多基因家族存在这一事实不符。

因此，本发明利用本实验室短小蛇根草的转录组数据，从实验室温室培养的短小蛇根草无菌苗中分离和鉴定出一条新的色氨酸脱羧酶基因，并将其命名为OpTDC2。利用大肠杆菌进行异源重组表达蛋白OpTDC2以验证其活性，并对其进行Ni-柱亲和纯化以及酶学性质研究。

发明内容

本发明目的在于从药用植物短小蛇根草无菌苗中分离和鉴定了一条新的色氨酸脱羧酶基因OpTDC2，利用大肠杆菌进行异源重组表达蛋白OpTDC2，并公开了其酶学性质及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2，所述色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种上述的色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达方法，通过将色氨酸脱羧酶基因OpTDC2构建至原核表达载体pCold TF中得到重组质粒pCold TF-OpTDC2，并将阳性重组质粒pCold TF-OpTDC2转入BL21(DE3)感受态细胞中组成重组菌株。重组菌株在诱导剂IPTG的诱导下表达出可溶性蛋白OpTDC2。所述重组质粒pCold TF-OpTDC2的序列如SEQ ID NO.4所示，其中原核表达载体pCold TF的序列如SEQ ID NO.3所示。其中，构建重组质粒pCold TF-OpTDC2时，先提取短小蛇根草无菌苗全基因组RNA，并将其反转录获得全基因组cDNA。设计色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的特异性引物，扩增得到色氨酸脱羧酶基因OpTDC2全长编码框序列，将扩增得到的色氨酸脱羧酶基因OpTDC2全长编码框序列与双酶切后的pCold TF质粒片段进行同源重组连接从而构建得到重组表达质粒pCold TF-OpTDC2。

一种上述可溶性蛋白OpTDC2在色氨酸催化反应中的应用。