[发明专利]无损分析间充质干细胞膜蛋白的方法

权利要求书

1.一种分析细胞膜蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：

先将适体引物，辅助引物和环状DNA模板的混合物于缓冲液中，95℃加热5分钟使其变性，然后冷却至室温使其互补成DNA三体复合物结构；

之后，为了防止适体的内吞，将盐酸氯丙嗪添加到培养基中，并在二氧化碳恒温细胞培养箱中与细胞孵育30分钟；

接着，将含有DNA三体复合物的适体-蛋白质结合缓冲液和细胞在37℃下孵育60分钟，实现对靶标细胞膜蛋白原位成像的定性分析；

然后，用PBS洗去适体-蛋白质结合缓冲液，并加入RCA反应缓冲液和细胞孵育2小时后，将上清液中收集起来去检测荧光信号强度，实现对靶标细胞膜蛋白的异位荧光的定量分析；

最后，将经过分析后的细胞进行蛋白质印迹法和CCK-8的测定，来检测膜蛋白表达和细胞活性的变化；

所述的RCA反应缓冲液含有5μL的10μM分子信标；

所述的适体引物如SEQ ID No 1所示，其5′末端标记了荧光基团；

所述的辅助引物如SEQ ID No 2所示；

所述的环状DNA模板如SEQ ID No 3所示；

所述的分子信标如SEQ ID No 4所示，其5′和3′端分别修饰了绿色荧光基团FAM和猝灭基团BHQ。

2.根据权利要求1所述的分析细胞膜蛋白的方法，其特征在于所述的盐酸氯丙嗪为100μM。

3.根据权利要求1所述的分析细胞膜蛋白的方法，其特征在于所述的适体-蛋白质结合缓冲液为150nM。

4.根据权利要求1所述的分析细胞膜蛋白的方法，其特征在于所述的适体-蛋白质结合缓冲液为DMEM培养基。

5.根据权利要求4所述的分析细胞膜蛋白的方法，其特征在于所述的适体-蛋白质结合缓冲液含4.5g/L葡萄糖。

6.根据权利要求4所述的分析细胞膜蛋白的方法，其特征在于所述的适体-蛋白质结合缓冲液含1mg/mL的BSA、10v/v％FBS和5mM的MgCl₂之一种或几种。

7.根据权利要求1所述的分析细胞膜蛋白的方法，其特征在于所述的RCA反应缓冲液还包括10mM的dNTPs，5U/μL的DNA聚合酶，10×聚合酶反应缓冲液和DMEM。

8.根据权利要求1所述的分析细胞膜蛋白的方法，其特征在于所述的RCA反应缓冲液还包括2μL的10mM的dNTPs，2μL的5U/μL的DNA聚合酶，10μL的10×聚合酶反应缓冲液和81μL的DMEM。

9.根据权利要求1所述的分析细胞膜蛋白的方法，其特征在于所述的适体引物与膜蛋白为CD44结合。

10.根据权利要求1所述的分析细胞膜蛋白的方法，其特征在于所述的荧光基团为Cy5。

11.根据权利要求1所述的分析细胞膜蛋白的方法在对靶标细胞实施原位成像的无损分析中应用。

12.根据权利要求1所述的分析细胞膜蛋白的方法，其特征在于所述的细胞为间充质干细胞。