[发明专利]基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测试剂盒

说明书

本发明提供一种基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019‑nCoV核酸定量检测试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增新型冠状病毒2019‑nCoV RNA的orf1ab基因15300‑15400nt的上游引物和下游引物，和用于扩增新型冠状病毒2019‑nCoV RNA的N基因27800‑27960nt的上游引物和下游引物；以及检测上述二个基因具有两种不同荧光标记的三条探针，其中二条不同荧光标记的探针检测同一个基因，另一条标记荧光的探针检测另一个基因。本发明筛选到上述两组高效特异的引物探针组合，其中orf1基因是用于确认病毒阳性的基因，可作为特异性的确认基因；N基因是用于筛查病毒阳性的基因，可用于初步筛选基因。

技术领域

本发明涉及数字PCR技术领域，具体涉及基于微液滴数字PCR技术的 新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测试剂盒。

背景技术

目前一线临床检测中疑似病例越来越多，检测方法的准确性十分重要。 因此高灵敏度、高准确性的对病毒进行检测是病毒防控的重要一步。因此， 新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测，尤其是高灵敏度定量检测具有重要 的应用价值。

基于微液滴的数字PCR技术(Digital PCR,dPCR)是近年来发展出的一 个新型的高灵敏度检测和定量核酸的技术。数字PCR技术具有灵敏度高、 准确性强、反应全封闭和全集成等技术优点，将在核酸检测和分子诊断领域 发挥巨大的应用价值。本发明基于微液滴数字PCR技术，实现对新型冠状 病毒2019-nCoV核酸的准确定量，针对重大疫情检测准确性的需求，具有 重要应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒 2019-nCoV核酸定量检测系统，它能够实现对新型冠状病毒2019-nCoV核酸 的精准绝对定量。

在一种实施方式中，基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019- nCoV核酸定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：用于扩增新型冠状病毒2019- nCoV RNA的orf1ab基因15300-15400nt的上游引物和下游引物，和用于扩增 新型冠状病毒2019-nCoV RNA的N基因27800-27960nt的上游引物和下游引 物；以及，检测上述二个基因具有两种不同荧光标记的三条探针，其中二条 不同荧光标记的探针检测同一个基因，另一条标记荧光的探针检测另一个基 因。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括：非感染的线性化双链质粒的质 控标准品和检测所述质控标准品的探针，所述质控标准品的探针与检测所述 新型冠状病毒2019-nCoV的特异探针组合无交叉反应。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括：用于扩增和检测人管家基因的 引物和探针，其作为内对照质控样本质量、提取、逆转录和PCR检测过程。

在一种实施方式中，所述人管家基因是人ABL1基因，用于扩增所述 ABL1基因的上游引物是SEQ ID NO： 5:TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTA；和下游引物是SEQ ID NO：6:GCTTCACACCATTCCCCATTGT；和探针是SEQ ID NO：10: AAGCTCCGGGTCTTAG。

在一种实施方式中，所述试剂盒包括检测orf1ab基因上游引物SEQ ID NO：1:CCTTATGGGTTGGGATTATC；和下游引物SEQ ID NO： 2:AGCAAGAACAAGTGAGGC；和探针SEQ IDNO：7: AATGTGATAGAGCCATGC。

在一种实施方式中，所述试剂盒包括检测N基因上游引物SEQ ID NO： 3:CTTGTTTTCTTAGGAATCATCAC；和下游引物SEQ ID NO：4: ACATATGGTTGATGTTGAGTACA；和探针SEQ ID NO： 8:CTGTAGCTGCATTTCACCA和SEQ ID NO：9: CTGTAGCTGCATTTCACCA。