[发明专利]一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法及应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：所述方法通过两步扩增即PCR扩增以及将PCR产物进行转录扩增得到RNA，称其为target RNA，即目标RNA，设计crRNA的核酸序列，利用Cas13a-crRNA复合物检测target RNA；

具体的步骤为：target RNA存在时能够激发Cas13a-crRNA复合物的核酸特异性识别引发的附属切割能力，即切割无关单链RNA；在此情况下，若选择合成一条RNA，将其一端修饰荧光基团，另外一端修饰淬灭基团，制备成reporter RNA，即报告RNA，reporter RNA就能被Cas13a酶切，产生增强的荧光信号进行输出；此荧光信号的变化和待检测细菌的浓度能够成线性关系，能够检测和定量细菌。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：通过两步扩增待检测细菌的DNA来得到target RNA，当Cas13a-crRNA检测到相应的targetRNA时，即target RNA和crRNA能够互补配对，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM脱离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加能够与微生物浓度成线性关系，能够特异性地检测和定量特定细菌；

或者，所述方法检测限为2CFU/mL；检测动态区间为10⁰到10⁷CFU/mL；检测所需时间从样品制备直到得到结果总共需要3-4小时。

3.根据权利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：步骤如下：

⑴样品简单前处理，裂解微生物细胞，释放基因组DNA(gDNA)；

⑵PCR扩增，对微生物特异性基因片段进行扩增；

⑶体外转录，将扩增后的DNA转录为RNA，即为target RNA；

⑷荧光检测，即可检测目的基因组微生物DNA浓度。

4.根据权利要求3所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：所述步骤⑵中微生物特异性基因片段为金葡菌的nuc基因。

5.根据权利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：所述crRNA的核苷酸序列为SEQ NO.1，所述Target RNA的核苷酸序列为SEQ NO.2，PCR引物序列分别为SEQ NO.3和SEQ NO.4，所述reporter RNA核苷酸序列为SEQ NO.5。

6.根据权利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：所述微生物为金黄色葡萄球菌。