[发明专利]一种快速检测乙型流感病毒的RDA方法及试剂盒

说明书

本发明公开一种快速检测乙型流感病毒的RDA方法及试剂盒，包括特异性引物对以及RDA荧光标记探针，以实现对乙型流感病毒（FluB）进行安全、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。此方法提供的试剂盒可省去核酸提取步骤，并在37～42℃恒温条件下、20min内实现乙型流感病毒的检测，特异性为100％，非常适用于现场快速检测。与普通PCR方法相比，RDA荧光法是在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短。因此，本发明的方法及其试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、成本低廉等特点，为乙型流感病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种基于RDA荧光法检测技术检测乙型流感病毒核酸的引物对、探针及相关试剂盒。

背景技术

乙型流感病毒(Influenza B virus，FluB)，又称B型流感病毒，主要有两种亚型：Victoria型和Yamagata型对人体健康会产生较大的威胁。乙型流感是一种传染性强、传播速度快的疾病，冬春季节流行为主，可引起局部爆发流行，但不会引起世界性流感大流行，患者感染的年平均死亡率远远大于甲型H1N1流感。人群对乙型流感病毒普遍易感，特别是当两个谱系之间的流行发生转换时，常可引起局部地区的暴发或流行，对人类公共卫生安全形成重大威胁。乙型流感病毒主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播，可以感染各个年龄段的人群，特别在儿童和老年造成的影响较大。患者感染后起病急骤，畏寒、发热，体温在数小时至24小时内升达高峰，胃肠道症状较其他类型流感多见。

乙型流感病毒感染的症状与甲型流感病毒、普通细菌感染的症状相似性较高，患者往往会选择基层社区诊疗机构进行诊断。目前社区可以利用的基于抗原抗体的检测手段临床上存在一定的窗口期，利用核酸扩增手段检测乙型流感可以有效缩短窗口期，提高检测灵敏度。传统的流感核酸检测方法大多基于PCR，检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，需要多个操作过程，包括病毒的裂解，病毒RNA提取和分子检测，整个过程通常集中在实验室的内进行，需要精密的仪器和熟练的操作人员。然而这些条件在基层社区诊疗机构往往难以获得，严重阻碍了流感的快速诊断。目前仍然缺乏适合基层检验的简单便宜自动化程度高的乙型流感检测试剂盒。

随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如LAMP（环介导核酸扩增技术）、HDA（解旋酶依赖等温核酸扩增技术）等均可在等温条件下扩增 DNA。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的 PCR 仪的依赖。若能在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有乙型流感病毒检测技术的缺陷和不足。研究得到一种乙型流感病毒（FluB）RDA荧光法检测试剂盒，实现乙型流感病毒的快速检测，在检测FluB的整个过程中，从样本处理到结果完成，仅需20-30min，大大缩短了常规的检测时间，提高检测效率。

本发明目的在于，提供优选后的检测乙型流感病毒的探针及引物对。

所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .2所示。

优选地，采用两种方案设计RDA荧光标记探针，第一种方案为：在靶标区域选择25-35bp保守序列为探针序列，5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代。第二种方案为：探针长度为 46-52 个核甘酸，其中至少 30个位于 THF 位点的 5’端，另外至少 15 个位于其 3’端。通过系列实验比对，两种探针设计方案均适用于RDA荧光检测方法，在检测的灵敏度和特异性上无明显差异。