[发明专利]一种快速检测猪瘟病毒（CSFV）的RDA方法及试剂盒

说明书

本发明公开一种快速检测猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）的RDA方法及试剂盒，包括特异性引物对以及RDA荧光标记探针，以实现对猪瘟病毒（CSFV）的安全、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。本发明中提供的试剂盒可省去核酸提取步骤，在恒温条件下20min内实现猪瘟病毒（CSFV）的检测，特异性为100％，与普通PCR方法相比，RDA荧光法在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短，适用于现场快速检测。本发明的方法及其试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、成本低廉等特点，可为猪瘟病毒（CSFV）现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种基于RDA荧光法检测技术检测猪瘟病毒（CSFV）的引物对、探针及相关试剂盒。

背景技术

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fevervirus，CSFV）引起猪的以稽留高热、皮肤和黏膜出现大量出血点为主要特征的一种高度接触性、致死性的传染病，主要通过呼吸道和消化道传染，传播速度快，发病率和病死率高，给全球养猪业带来了巨大的经济损失，被世界动物卫生组织列为必须报告的动物传染病，被我国农业部列为一类动物疫病，是危害我国养猪业最严重的动物疫病之一。为有效预防和控制该病，急需加强CSFV检测技术的研究工作。目前，猪瘟的检测主要包括病毒的分离与鉴定、血清学及分子生物学检测方法。病毒分离鉴定操作繁琐，周期长，不适于大批量样品检测；血清学方法不能用于CSFV感染的早期诊断；PCR易引起交叉污染，且不能定量。

实时荧光定量PCR是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，它融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。因其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面得到了广泛应用。PCR检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，需配备专门的PCR实验室和专业操作人员，其成本和应用范围均受到一定限制。随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如LAMP（环介导核酸扩增技术）、HDA（解旋酶依赖等温核酸扩增技术）等均可在等温条件下扩增核酸分子。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的PCR仪的依赖。若能在更低的温度条件下，甚至在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有猪瘟病毒检测技术的缺陷和不足。研究得到一种猪瘟病毒（CSFV）RDA荧光法检测试剂盒，实现猪瘟病毒（CSFV）的快速检测，在检测CSFV的整个过程中，从样本处理到结果完成，仅需20-30min，大大缩短了常规的检测时间，提高检测效率。该技术可结合便携式的样本处理技术，不依赖于实验室设备，可采样现场进行检测，对猪瘟病毒感染等疾病控制具有重要意义。

本发明目的在于，提供优选后的检测猪瘟病毒的探针及引物对。

所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .2所示。

优选地，采用两种方案设计RDA荧光标记探针，第一种方案为：在靶标区域选择25-35bp保守序列为探针序列，5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代。第二种方案为：探针长度为 46-52 个核甘酸，其中至少 30个位于 THF 位点的 5’端，另外至少 15 个位于其 3’端。通过系列实验比对，两种探针设计方案均适用于RDA荧光检测方法，在检测的灵敏度和特异性上无明显差异。