[发明专利]一种快速检测淋病奈瑟菌的RDA方法及试剂盒

说明书

本发明公开一种快速检测淋病奈瑟菌的RDA方法及试剂盒，包括特异性引物对以及RDA荧光标记探针，以实现对淋病奈瑟菌（NG）进行安全、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。此方法提供的试剂盒可省去核酸提取步骤，并在37～42℃恒温条件下、20min内实现淋病奈瑟菌的检测，特异性为100％，非常适用于现场快速检测。与普通PCR方法相比，RDA荧光法是在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短。因此，本发明的方法及其试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、成本低廉等特点，为淋病奈瑟菌的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种基于RDA荧光法检测技术检测淋病奈瑟菌核酸的引物对、探针及相关试剂盒。

背景技术

淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）俗称淋球菌，为革兰阴性双球菌，是人类常见性传播疾病（STD）的主要病原体，主要寄居在急性尿道炎和阴道炎的脓性分泌物的白细胞中。人是淋病奈瑟菌的唯一的天然宿主，此菌感染人后导致泌尿生殖道化脓性炎症，如不及时治疗，易出现性欲减退、勃起不坚、阳痿、早泄及神经衰弱等症状，还可能诱发不孕不育症等。

淋病在世界上广泛流行，据2017年WHO 最新估计每年全球大约有7830万新发淋病病例。在国内，淋病位居乙类法定传染病报道发病数的第五位，成为我国《中华人民共和国传染病防治法》规定的重点防治的乙类传染病。有研究发现，女性淋病的患病率（0.08%） 高于男性（0.02%），约有60%的女性淋病患者呈隐性感染或带菌状态。女性无症状感染者的大量存在增加了淋病传播的风险，同时延误了及时治疗的时机，更易导致并发症，引起不孕、异位妊娠等不良后果。因此，在孕前体检中早期筛查出女性淋病患者对预防新生儿淋病、执行优生优育政策具有重要意义。

淋病奈瑟菌感染的病原学检测的方法主要有涂片检查法和NG的细胞培养法，但是该种方法误诊、漏诊率较高，阳性检出率相对降低。淋病奈瑟菌的分子生物学检测方法大多基于PCR，使用荧光标记探针实时检测，检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，以及专门的PCR实验室和专业操作人员，其成本和应用范围均受到一定限制。随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温 核酸扩增技术已得到快速发展，如LAMP（环介导核酸扩增技术）、HDA（解旋酶依赖等温核酸扩增技术）等均可在恒温条件下扩增靶标核酸。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的 PCR 仪的依赖。若能在 更低的温度条件下，甚至在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化， 并有利于此类技术更广范围的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有淋病奈瑟菌检测技术的缺陷和不足，研究得到一种淋病奈瑟菌（NG）RDA荧光法检测试剂盒，实现淋病奈瑟菌的快速检测，在检测NG的整个过程中，从样本处理到结果完成，仅需20-30min，大大缩短了常规的检测时间，提高检测效率。

本发明目的在于，提供优选后的检测淋病奈瑟菌的靶标序列、引物对及探针。

所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .2所示。

在本专利中我们采用两种方案设计RDA荧光标记探针，第一种方案为：在靶标区域选择25-35bp保守序列为探针序列，5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代。第二种方案为：探针长度为 46-52 个核甘酸，其中至少 30 个位于 THF 位点的 5’端，另外至少 15 个位于其 3’端。通过系列实验比对，两种探针设计方案均适用于RDA荧光检测方法，在检测的灵敏度和特异性上无明显差异。