[发明专利]基于杂交链式反应的荧光DNA传感器及E542K基因检测方法

说明书

本发明涉及一种基于杂交链式反应的荧光DNA传感器及E542K基因检测方法。本发明所提供的基于杂交链式反应的荧光DNA传感器，包括引发链、第一发夹探针及第二发夹探针，所述第一发夹探针的两端分别标记有荧光基团及相应的荧光猝灭基团，所述第二发夹探针的两端分别标记有荧光基团及相应的荧光猝灭基团，所述引发链为E542K基因，所述引发链可与所述第一发夹探针结合，打开所述第一发夹探针的发夹结构，使所述第一发夹探针与所述第二发夹探针结合，激活杂交链式反应，形成长双链DNA，使所述长双链DNA荧光增强，从而定量检测所述E542K基因。该基于杂交链式反应的荧光DNA传感器，提高了E542K基因检测的灵敏度与选择性，具有简单、快速、高效的优势。

技术领域

本发明涉及化学与生物传感技术领域，特别是涉及基于杂交链式反应的荧光DNA传感器及E542K基因检测方法。

背景技术

循环肿瘤DNA是一类重要的肿瘤标志物，能够实时反映肿瘤的动态变化，因此在多种肿瘤的早期诊断、实时监控、预后评估等方面体现出重要的临床价值。PIK3CA基因是一种重要的循环肿瘤DNA，可以编码蛋白质，调控细胞增殖、分化等一系列细胞活动，其中，E542K基因是野生型PIK3CA基因热点突变区域的一种突变型基因，在乳腺癌、结肠癌和肺癌中均有该基因的突变，可作为肿瘤标志物用于临床上的辅助诊断。

循环肿瘤DNA的检测方法主要有数字PCR、BEAMing及NGS等，但是这些方法具有操作复杂、价格昂贵、耗时耗力、实验条件苛刻等缺点。近年来，随着检测技术的不断提高，循环肿瘤DNA的检测出现了电化学检测、表面增强拉曼散射检测等方法，但这些方法都存在检测信号不稳定的问题，使得这些方法在实际应用中受到制约。

发明内容

基于此，为了克服上述问题，提供一种基于杂交链式反应的荧光DNA传感器及E542K基因检测方法，其中，E542K基因既是靶标分子又是所述引发链，能够激活杂交链式反应，提高检测的灵敏度与选择性，并利用反应前后荧光强度的变化实现E542K基因的定量检测。

一种基于杂交链式反应的荧光DNA传感器，包括引发链、第一发夹探针及第二发夹探针，所述第一发夹探针的两端分别标记有荧光基团及相应的荧光猝灭基团，所述第二发夹探针的两端分别标记有荧光基团及相应的荧光猝灭基团，所述引发链为E542K基因，所述引发链可与所述第一发夹探针结合，打开所述第一发夹探针的发夹结构，使所述第一发夹探针与所述第二发夹探针结合，激活杂交链式反应，形成长双链DNA，使所述长双链DNA荧光增强，从而定量检测所述E542K基因。

进一步地，所述荧光基团为6-羧基荧光素(FAM)，所述荧光猝灭基团为黑洞猝灭基团(BHQ1)。

进一步地，所述第一发夹探针包括特异性识别E542K基因的碱基序列，所述第一发夹探针的碱基序列为5’-BHQ1-AAAATCACTAAGCAGGCAAAGTCCTGCTTAGTGATTTTAGAGAG-FAM-3’。

进一步地，所述第二发夹探针包括与所述第一发夹探针互补的碱基序列，所述第二发夹探针的碱基序列为5’-FAM-ACTTTGCCTGCTTAGTGATTTTCTCTCTAAAATCACTAAGCAGG-BHQ1-3’。

一种所述的基于杂交链式反应的荧光DNA传感器的E542K基因检测方法，包括以下步骤：

S1、E542K基因、第一发夹探针与第二发夹探针首次开盖使用前先离心，分别将其溶于二次水中配成100μM的母液，再用缓冲液稀释成E542K基因溶液、第一发夹探针溶液和第二发夹探针溶液，4℃保存待用；

S2、将第一发夹探针溶液与第二发夹探针溶液分别加热并冷却至室温备用；

S3、将所述步骤S2中加热后的第一发夹探针溶液、第二发夹探针溶液与不同浓度的E542K基因溶液在缓冲液中混合反应，得到反应液，检测荧光信号强度。