[发明专利]Ndufs2基因条件性点突变小鼠模型及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种Ndufs2基因条件性点突变小鼠模型及其构建方法和应用，所述小鼠模型Ndufs2基因的第425位的赖氨酸突变为精氨酸。本发明构建的小鼠模型为制备预防或者治疗心脑血管相关疾病药物提供有效的实验动物模型，具有良好的医学临床应用前景，在制备预防/治疗心脑血管疾病药物中有很大的应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种Ndufs2基因条件性点突变小鼠模型及其构建方法和应用。

背景技术

基因突变小鼠模型的建立和应用对生命科学、基础医学的发展具有里程碑式的意义，对临床疾病的认识和治疗也起到了极大的推动作用。线粒体呼吸链功能的异常会直接或间接地引起多种严重的生理缺陷，而要想攻克这些医学难题，利用基因突变小鼠模型阐明呼吸链的结构信息和功能机理至关重要。在呼吸链CI～CIV四个复合物中，复合物CI的致病突变位点最多也最复杂，迄今为止已发现CI的100多个突变位点与疾病相关。非胰岛素依赖性糖尿病、MELAS综合征、Leigh氏脑病(亚急性坏死性脑病)以及多种癌症的发生都与CI中的突变有关。复合体I由45种蛋白质组成，有两个膜臂，Ndufs2是复合体I的一个亚基，位于复合体I亲水性膜臂，接近线粒体基底部，属亲水性蛋白质。NADH脱氢酶的亚基构成了复合体I催化核心，Ndufs2便是其催化核心之一。

关于能量代谢的科学研究是生物学领域有趣且意义重大的课题。经过一个多世纪的努力，人类对线粒体呼吸链的研究已经取得了可喜的成就。科学家已经认识到“亚基—呼吸复合物—超级复合物”这一复杂而有序的呼吸链组织形式，对呼吸体中电子传递和能量转换的分子机制有了较为深入的了解，但是，尚不清楚呼吸体亚基Ndufs2基因的点突变对超级复合物的结合与分离的影响，对适应不同的细胞状态究竟有怎样具体的生物学意义。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种Ndufs2基因条件性点突变小鼠模型及其构建方法和应用，为制备预防或者治疗心脑血管相关疾病药物提供了新的策略。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种Ndufs2基因条件性点突变小鼠模型，所述小鼠模型Ndufs2基因的第425位的赖氨酸突变为精氨酸。

上述Ndufs2基因条件性点突变小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：

S1：体外转录sgRNA；

S2：构建Cas9打靶载体和donor载体；

S3：将Cas9打靶载体、sgRNA及donor载体显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵进行同源重组，获得F0代小鼠；

S4：经PCR和测序验证阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得可稳定遗传的F1代小鼠模型。

进一步的，所述步骤S1包括如下步骤：确定小鼠待敲除基因的靶位点，设计针对Ndufs2-T1、Ndufs2-T2的sgRNA，所述Ndufs2-T1的sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述Ndufs2-T2的sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，所述步骤S2包括如下步骤：

a、人工合成5′端带有不同酶切位点识别序列的靶序列寡核苷酸引物，通过PCR对两对引物直接退火，合成出携带不同的黏性末端的靶序列DNA短片段，将其插入到CRISPR/Cas9表达载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-h SpCas9 U6启动子下游，构建小鼠Ndufs2两个靶点的CRISPR/Cas9打靶载体pX330-U6-Ndufs2T1-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9和pX330-U6-Ndufs2T2-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9；

b、构建Donor载体，所述Donor载体的序列如SEQ ID NO.3所示。