[发明专利]一种表达荧光素酶的重组A型塞尼卡病毒

说明书

本发明提供了一种拯救表达荧光素酶(NLuc)的重组A型塞尼卡病毒(rSVA‑NLuc)的方法。本发明首先提供了一种用于rSVA‑NLuc拯救的cDNA clone，其5′端和3′端分别包含T7 RNA聚合酶和Not I酶切位点序列，2A和2B序列之间插入NLuc和T2A的融合序列NLuc‑T2A。所述的rSVA‑NLuc cDNA clone经Not I线性化后可直接转染BSR‑T7/5细胞，以拯救rSVA‑NLuc。rSVA‑NLuc经鉴定后进行病毒特性分析，包括间接免疫荧光、噬斑形态、生长动力曲线及外源蛋白表达等。

技术领域

本发明属于重组病毒构建技术领域，具体涉及一种表达荧光素酶的重组A型塞尼卡病毒。

背景技术

A型塞尼卡病毒(Senecavirus A，SVA)，又称塞尼卡谷病毒(Seneca Valleyvirus，SVV)，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、塞尼卡病毒属(Senecavirus)成员。SVA在全球属于新发病原，可感染猪，导致自发性水疱型临床症状，难与口蹄疫、水疱性口炎及猪水疱病感染区分。感染SVA的猪鼻吻会出现水疱性病变，通常为大小不一、充满液体的水疱，破裂后可形成溃疡面，多日后形成结痂。水疱性及溃疡性病变多出现于蹄冠带和趾间隙，导致边缘上皮疏松坏死，严重者站立和行走困难。患病动物同时伴有厌食、精神沉郁、体温升高等现象。某些患病仔猪经历3～10天临床反应，症状可消退并临床康复。

SVA是塞尼卡病毒属的唯一成员。病毒粒子呈二十面体对称，直径约27nm，无囊膜。基因组为线性、单股、正链的RNA，全长约7.2～7.3nt，两端存在非编码区，3′末端为Poly A尾。病毒基因组只含一个开放阅读框(open reading frame,ORF)，编码含2181个氨基酸的多聚蛋白前体，进而裂解为一个前导蛋白和三个多聚蛋白(P1、P2和P3)。P1基因编码四个结构蛋白，依次为VP4、VP2、VP3和VP1，四者构成了病毒的衣壳；P2基因编码三个非结构蛋白2A、2B和2C；P3基因编码四个非结构蛋白3A、3B、3C和3D。

萤光素酶(luciferase,NLuc)是一个经基因工程改造的小分子酶，分子量为19.1kD，是新型生物发光报告蛋白。NLuc可催化一种新型底物furimazine，产生高强度的辉光型发光现象。NLuc催化的生物发光反应不依赖ATP，自发光背景低，光信号较传统荧光素显著增强，同时抑制背景发光，可获得极高检测灵敏度。NLuc作为一种荧光示踪蛋白(Genbank登录号：MH037010)，因ORF较短(516bp)，因此极大方便了基因操作，例如将其亚克隆至质粒载体。

SVA是一种新发病毒，其在体内致病机制的研究尚不深入，若通过反向遗传技术构建表达NLuc的重组SVA，必将加速该病毒在体内致病机制的研究，然而目前尚未见类似的报道。

发明内容

本发明目的是提供一种表达荧光素酶(NLuc)的重组A型塞尼卡病毒(rSVA)，从而方便该病毒在体内嗜性及致病机制的研究。

本发明首先提供一种用于拯救表达NLuc的rSVA的核酸片段，所述的核酸片段结构如下：

5′-L-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-NLuc-T2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3′；

其中，L为病毒的Leader蛋白；VP4、VP2、VP3和VP1为病毒的结构蛋白；2A为病毒的非结构蛋白；NLuc为荧光素酶；T2A为自剪切肽；2B、2C、3A、3B、3C和3D为病毒的非结构蛋白。

作为实施例的一种具体记载，所述的核酸片段的序列为SEQ ID NO:1；

本发明所提供的核酸片段用于在细胞内拯救表达NLuc的rSVA；

所述的细胞为BSR-T7/5细胞。