[发明专利]一种牛支原体基因编码的蛋白在黏附宿主细胞中的应用

说明书

本发明属于动物传染病防治领域，涉及黏附能力降低的牛支原体基因缺失的突变株。蛋白基因Mbov_0503从牛支原体HB0801基因组中克隆获得。根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，对Mbov_0503基因进行了修饰，将牛支原体色氨酸密码子UGA突变成大肠杆菌中编码色氨酸的密码子UGG，获得重组蛋白Mbov0503。本发明克隆的蛋白基因的序列如SEQ ID NO:13所示，编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:14所示。本发明的突变株从突变体库筛选的黏附缺陷株。该突变株对宿主EBL细胞的黏附能力，对MDBK细胞的跨膜传播能力及对细胞间紧密连接的破坏能力较野生株显著下降。可在牛支原体致病和防控中应用。

技术领域

本发明是申请号为2019101283763，申请日为2019年2月21日提交申请的分案申请。

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到牛支原体Mbov_0503基因缺失突变菌株T4.4和该基因编码的功能未知蛋白Mbov0503。突变位点位于牛支原体基因组586830位点后，位于Mbov_0503基因313位点后。与野生菌株相比，该突变株对宿主细胞的黏附能力显著缺陷，对细胞间紧密连接的破坏能力和跨膜传播能力显著降低。重组蛋白rMbov0503可以黏附于宿主细胞和细胞膜蛋白。该突变株和蛋白可望在牛支原体致病机制和免疫防控领域具有应用前景。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis，M.bovis)主要导致牛支气管肺炎，同时还可导致乳腺炎、关节炎、流产等多种疾病，严重危害世界养牛业。在欧洲，每年约三分之一的犊牛肺炎由牛支原体引起，损失高达5.76亿欧元；在美国，由牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺炎所造成损失每年达到1.08亿美元(Rosengarten等，1999)。我国2008年华中农业大学首次报道牛支原体肺炎，此后发现全国绝大部分省市均有牛支原体肺炎，发病率为80％以上，病死率平均为10％，最高可达到60％(石磊等，2008)。同时，牛乳腺炎的流行也很普遍(张慧等，2015)，给我国养牛业造成了巨大经济损失。

黏附是支原体感染和致病的第一步，也是研究支原体病防控措施的重要靶点。关于牛支原体的黏附机制研究尚处于初级阶段，至今似乎未发现与人肺炎支原体类似的主要黏附蛋白和顶端黏附细胞器。然而，已报道了一些黏附相关蛋白如α-enolase(Song等，2012)、VSPs(Sachse等，2000)和NADH Oxidase(Zhao等，2017)，但这些蛋白的功能研究大部分基于重组蛋白，在牛支原体水平的实际黏附过程中所起作用尚不清楚。为了了解牛支原体的黏附基因，申请人利用牛支原体突变体库、细胞黏附和转移小室(transwell)跨膜传播试验等，鉴定了黏附缺陷突变体。本发明涉及一株细胞黏附能力缺陷突变体，突变基因为Mbov_0503；该基因编码功能未知蛋白Mbov0503，本发明证明该蛋白为一种黏附相关蛋白。

发明内容

本发明的目的在于一种牛支原体基因编码的蛋白在黏附宿主细胞中的应用，所述的应用是基于申请人得到一株黏附能力降低的牛支原体缺失基因Mbov-0503的突变株T4.4。由该牛支原体缺失基因Mbov-0503编码的蛋白Mbov0503可以独立黏附于宿主细胞，本发明获得的突变株T4.4相较野生菌株呈现显著的黏附缺陷表型，对细胞间紧密连接的破坏能力和跨膜传播能力较野生菌株均降低。基于黏附、对细胞间紧密连接的破坏和跨膜传播能力等是支原体感染和致病的毒力相关因子，该突变株可望在牛支原体致病机制和免疫防控领域有潜在应用前景。

为了实现本发明的目的，申请人所在华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室从牛支原体基因缺失突变体库中筛选出一株黏附缺陷菌株T4.4。进一步验证确定该突变菌株的对细胞间紧密连接的破坏能力和跨膜传播能力较野生菌株均显著降低。该突变菌株缺失基因为未知基因Mbov_0503，其N端具有一个跨膜结构域，经进一步验证，该基因编码的蛋白Mbov0503具有黏附宿主细胞的能力。本发明为阐明牛支原体致病机制提供了理论依据，并为开发特异性防控制剂提供了潜在靶点。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：