[发明专利]生产熊果酸和齐墩果酸的重组酵母菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了生产熊果酸和齐墩果酸的重组酵母菌及其构建方法和应用，构建方法为：通过同源重组的方法，向重组菌Sc310LCZ02中导入香树脂醇C‑28位氧化酶编码基因CYP716A12和拟南芥细胞色素‑NADPH‑还原酶1编码基因AtCPR1，得到重组菌株Sc310LCZ03；或向重组菌Sc310LCZ02中导入香树脂醇C‑28位氧化酶编码基因CYP716AL1和拟南芥细胞色素‑NADPH‑还原酶1编码基因AtCPR1，得到重组菌株Sc310LCZ04；重组菌株可以生产不同比例的熊果酸和齐墩果酸混合物。本发明为人工合成熊果酸和齐墩果酸奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及生产熊果酸和齐墩果酸的重组酵母菌及构建方法和应用。

背景技术

熊果酸和齐墩果酸都是在多种药用植物中能检测到的具有多种生物活性的五环三萜化合物，具有镇静、降低血糖、抗炎、抗菌、抗溃疡、抗氧化、抗糖尿病、抗癌等多种生物学效应。此外，虽然熊果酸和齐墩果酸各自都具备较好的抗癌活性，有研究表明，熊果酸和齐墩果酸协同用药能够相互增强彼此抗恶性细胞增殖的能力。在患皮肤癌的小鼠进行体内实验，熊果酸和齐墩果酸的协同活性也得到了验证。利用微生物细胞工厂同时合成熊果酸和齐墩果酸是实现其工业生产的有效途径，构建能够高效生产熊果酸和齐墩果酸的重组酵母菌并优化及生产过程具有重要应用价值。

酵母内源代谢途径可为三萜化合物的合成提供前体2,3-氧化鲨烯，随后的环氧化、氧化分别由多功能香树脂醇合酶、细胞色素P450酶完成。多功能香树脂醇合酶基因在不同的植物中都有发现。Fukushima等在蒺藜状苜蓿中发现一种多功能酶(CYP716A12)，既可以氧化α-香树脂醇生成熊果酸又能氧化β-香树脂醇生成齐墩果酸。Huang等在长春花中发现了另外一种C-28位氧化酶(CYP716AL1)，也既可以氧化α-香树脂醇生成熊果酸又能氧化β-香树脂醇生成齐墩果酸，在酿酒酵母WAT11菌株中共表达CrAS基因和CYP716AL1基因后，可以合成0.1mg/L熊果酸和0.045mg/L齐墩果酸。Huang等报道CrAS(GenBanK数据库，序号JN991165)是同时催化α-香树脂醇和β-香树脂醇合成的基因。目前已报道的微生物同时合成熊果酸和齐墩果酸的研究中，熊果酸和齐墩果酸的产量均非常低。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产α-香树脂醇和β-香树脂醇重组菌。

本发明的第二个目的是提供一种构建高产α-香树脂醇和β-香树脂醇重组菌的方法。

本发明的第三个目的是提供一种高产α-香树脂醇和β-香树脂醇重组菌制备α-香树脂醇和β-香树脂醇的用途。

本发明的第四个目的是提供一种生产熊果酸和齐墩果酸的重组酵母菌。

本发明的第五个目的是提供一种生产熊果酸和齐墩果酸的重组酵母菌的构建方法。

本发明的第六个目的是提供一种生产熊果酸和齐墩果酸的重组酵母菌发酵制备熊果酸和齐墩果酸的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种构建高产α-香树脂醇和β-香树脂醇重组菌的方法，包括如下步骤：

(1)通过同源重组的方法，向酿酒酵母菌(W303-1a)中导入多功能香树脂醇合酶编码基因CrAS和鲨烯环氧酶编码基因ERG1，得到高产α-香树脂醇和β-香树脂醇的重组菌Sc310LCZ01；

(2)通过同源重组的方法，向重组菌Sc310LCZ01中导入截短的3-羟基-3甲基戊二酰CoA还原酶编码基因tHMG1和法尼基焦磷酸合成酶编码基因ERG20，得到高产α-香树脂醇和β-香树脂醇的重组菌Sc310LCZ02；

所述多功能香树脂醇合酶编码基因CrAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述鲨烯环氧酶编码基因ERG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；