[发明专利]呼吸道病原多重RPA检测用引物群、检测试剂及试剂盒有效
申请号: | 202010074966.5 | 申请日: | 2020-01-22 |
公开(公告)号: | CN111154916B | 公开(公告)日: | 2022-07-05 |
发明(设计)人: | 陈愉生;李鸿茹;孙益乐;许能銮;郑奎城 | 申请(专利权)人: | 福建省立医院;福建省疾病预防控制中心;上海透景生命科技股份有限公司 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/93;C12R1/445;C12R1/46;C12R1/35;C12R1/22;C12R1/01;C12R1/385 |
代理公司: | 福州鼎新知识产权代理有限公司 35263 | 代理人: | 李向楠;杨慧娟 |
地址: | 350000*** | 国省代码: | 福建;35 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 呼吸道 病原 多重 rpa 检测 引物 试剂 试剂盒 | ||
本发明提供呼吸道病原多重RPA检测用引物群、检测试剂及试剂盒,通过对人巨细胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、嗜肺军团菌中的至少5种呼吸道病原进行RPA引物的设计改造,成功获得高特异性的多重RPA检测用引物群,并采用该引物群来配制检测试剂、制作试剂盒,从而推测其能够实现最多15重呼吸道病原菌的RPA检测,并且,还能缩短整个检测流程所需的时间,简化步骤。
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,特别是涉及呼吸道病原多重RPA检测用引物群、检测试剂及试剂盒。
背景技术
RPA技术(全称“重组酶介导扩增技术”) 被称为是可以替代PCR技术的核酸检测技术。RPA技术是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的技术。RPA技术主要依赖于三种酶:能结合引物的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶;这三种酶的混合物的最佳反应温度在37°C左右。RPA技术的原理为:重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列,一旦引物搜索到与之完全互补的同源序列,在单链DNA结合蛋白的帮助下,使双链DNA模板解链、引物与同源序列配对结合,并在DNA 聚合酶的作用下启动DNA合成,对双链DNA模板上的目标区域进行指数式扩增,与此同时,被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在RPA技术的扩增体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快,通常在1 h 内即能获得可检出水平的扩增产物。与PCR技术相比,RPA技术的整个反应不需要高温循环,简单快速,因此特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。
RPA技术的关键在于引物的设计。现有的PCR扩增引物多半是不适用的,因为RPA引物比PCR引物要长,通常需要达到30-38个碱基。并且,在设计RPA引物时,变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物设计不像传统PCR那样成熟,这就需要研究者自己摸着进行引物的设计和优化。由于RPA技术通常在等温条件下进行,使得其无法如普通PCR扩增通过调节反应时的退火温度和降温速率来避免多重检测时不同呼吸道病原引物组之间Tm值差异和扩增效率的不同所带来的多种扩增产物之间的互相干扰,也使得获得适合多重检测用的、高特异性的RPA扩增引物的难度非常大。目前,使用RPA技术进行单重检测的报道较多,最多实现4重检测。
急性呼吸道传染性疾病的临床诊断比较复杂,导致同一症状的病原往往高达10数种以上。基于RPA技术所具有的操作简单、扩增快速的优点。临床医学迫切希望开发出呼吸道病原多重检测用RPA引物群、检测试剂及试剂盒。
发明内容
本发明的目的之一在于提供呼吸道病原多重RPA检测用引物群,采用该引物群对待测样本的DNA和RNA中的任一种进行RPA扩增,并进行检测,能够一次实现5重以上(最多15重)呼吸道病原菌的检测,并且,还能缩短整个流程所需的时间,简化步骤。
呼吸道病原多重RPA检测用RPA引物群,该引物群由15 对引物中的至少5对组成,所述的15对引物的核苷酸序列分别为:
①人巨细胞病毒(简称:HCMV)
HCMV-F:5'biotin–CGGTACGGGCTGCAGGTAAAGTGCGATCAAGAACG 3'、
HCMV-R:5'NH2-C6-TTTTTTTTTCGTGCTTTTTAGCCTCTTTTTTTTTTTGCAGCTGCG
TCACGGGTCTAGCCGGCCATAATCAC 3';
②腺病毒(简称ADV)
ADV-F:5'biotin –CTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTCG 3'、
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