[发明专利]一种快速检测金针菇培养料中假单胞菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测培养料中抑制金针菇菌丝生长的假单胞菌（Pseudomonas migulae）的方法，以目标细菌的拓扑异构酶基因（简称Topo，位点NC_021250）作为特异性分子标记，设计出扩增抑制金针菇菌丝生长的假单胞菌的特异性引物，通过PCR扩增方法检测工厂环境中潜在的目标致病细菌，并验证了该鉴定方法的灵敏性，此方法可用于快速监测工厂栽培环境中的微生物安全问题，为金针菇工厂化发展增加保障。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测培养料中抑制金针菇菌丝生长的假单胞菌(Pseudomonas migulae)的方法。

背景技术

金针菇工厂化栽培产业体系在我国日趋成熟，并已经成为主导的金针菇生产模式。工厂栽培环境对金针菇生产至关重要，其洁净程度直接影响到金针菇的产量和品质。工厂生产中消毒环节十分关键，主要针对生产设备、床架、空气、地面等进行消毒，目的是尽量消除杂菌的污染。细菌体积小，种类多，易传播。金针菇工厂栽培过程中，车间空气中主要细菌种类是假单胞杆菌属和欧文氏细菌。近期发现一种假单胞菌(Pseudomonas migulae)可以抑制菌丝发菌，致使搔菌冲水后，不正常栽培瓶培养料颜色加深显黑，导致产量降低。病原细菌还会增加食品安全风险，因此，针对工厂环境进行该病原细菌的监测十分有必要。

核酸检测是细菌鉴定中较常用及简便的方法，通用引物扩增16S rRNA基因可将细菌鉴定到属水平。鉴定程序通常是得到病原菌纯培养后，设计引物进行聚合酶链式反应，通过测序获得其序列，经数据库比对后进行鉴定。工厂化栽培过程中对病原菌进行监测，需在未得到病原菌纯培养的材料，如空气、水、培养料等中直接检测病原细菌是否存在。特异性基因标记是一种简便、且可以准确鉴定病原细菌的方法，通过特异的片段大小来筛选目标微生物，并可应用于检测混合微生物样品中的目标微生物。

特异性基因标记检测是一种快速鉴定混合材料中是否存在目标微生物的方法，相比于平板分离法，它免去了从待测样品中不断分离目标微生物的繁琐过程，无需得到目标细菌的纯培养即可鉴定，具有快速、高效、准确的优点。且在细菌单菌落检测过程中，不同于通用引物16S rRNA基因序列分析，不需测序鉴定，而只需通过特异引物扩增并电泳检测特异性标记条带即可。

发明内容

本发明提供了一种快速检测培养料中抑制金针菇菌丝生长的假单胞菌(Pseudomonas migulae)的方法，选取拓扑异构酶基因(简称Topo，位点NC_021250)作为特异性分子标记，由此设计出扩增假单胞菌(Pseudomonas migulae)的特异性引物，根据扩增的特异片段检测工厂环境中潜在的目标致病细菌，该方法可用于快速监测工厂栽培环境中的微生物安全问题，为金针菇工厂化发展增加保障。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

以目标细菌Pseudomonas migulae的拓扑异构酶基因(简称Topo，位点NC_021250)作为特异性分子标记，根据Topo基因设计引物Topo-F(SEQ ID NO.1)和Topo-R(SEQ IDNO.2)。

一种快速检测培养料中抑制金针菇菌丝生长的假单胞菌(Pseudomonas migulae)的方法，包括以下步骤：

(1)采集搔菌阶段培养料，提取培养料总DNA；

(2)以培养料总DNA为模板，引物Topo-F(SEQ ID NO.1)和Topo-R(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增；

(3)将扩增产物进行核酸电泳检测，如果培养料样品中检测到1800bp的特异性扩增条带，则说明培养料中存在假单胞菌(Pseudomonas migulae)。

进一步地，PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃，10min，4℃保存。