[发明专利]一种蔗糖磷酸化酶在制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用

说明书

本发明公开了一种蔗糖磷酸化酶在制备2‑O‑α‑D‑葡萄糖基‑L‑抗坏血酸中的应用，以含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌经发酵获得的发酵液或发酵液离心后的湿菌体用缓冲液重悬的破碎液为催化剂，以L‑抗坏血酸为底物，以蔗糖为辅助底物，以pH为4.8‑6.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30‑55℃的条件下进行反应，获得AA‑2G。本发明采用蔗糖磷酸化酶高效生产AA‑2G，其产率为3.47g·L^‑1·h^‑1，较现有报道的B.longum来源的蔗糖磷酸化酶提高了34.5％，AA‑2G的最高浓度可达178g/L；本发明重组枯草芽孢杆菌能够高效分泌表达蔗糖磷酸化酶，将发酵液直接用于食品级AA‑2G的制备。

(一)技术领域

本发明涉及一种维生素C糖苷的制备，特别涉及一种蔗糖磷酸化酶在制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)中的应用。

(二)技术背景

L-抗坏血酸(又称维生素C，VC)是一种常见的水溶性维生素和人体所必须的营养元素，其结构如图1所示。缺乏VC会引起坏血病，心脏病，癌症等疾病，由于人体无法合成VC，因此必须从食物中获取。此外，也可作为调味剂，还原剂，抗氧化剂，漂白剂等，广泛应用于食品，饲料，化妆品和医药等领域。由于VC含连烯二醇结构，C₂位的氢氧根很容易被氧化，在空气中极不稳定，往往需要衍生化修饰，包括VC棕榈酸酯、VC甲基醚和VC糖苷。其中VC-糖苷具有稳定性强、安全性高、水溶性好和体内容易释放VC等优点。VC上存在多个糖基化位点，如图1所示，其中AA-2G的稳定性最好，也是通常所指的VC糖苷产品。AA-2G进入体内后能被α-葡萄糖苷酶分解为VC和D-葡萄糖，使VC可以在体内保持有活性的烯醇式结构，是VC的最佳替代品。所以，目前AA-2G被广泛应用于化妆品、食品、医疗保健及畜牧业个水产养殖等行业。

目前AA-2G的成熟生产技术是由日本林原公司在上世纪九十年代开发的，依赖耐高温环糊精糖基化转移酶和糖化酶的两步法生产技术(Aga H,et al.1991,Agriculturaland Biological Chemistry 55(7):1751-1756)。近几年，一步法AA-2G的生产工艺取得显著的进步，即采用来源于长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)的蔗糖磷酸化酶的一步糖基化法(Gudiminchi RK,et al.Chembiochem2017,18(14):1387-1390)。但仍存在缺点：①反应速率慢，催化时间过长(72h以上)；②底物VC的转化率低(约40％)；③酶的用量大。

本发明提供了一个更加高效实现一步法生产AA-2G的蔗糖磷酸化酶，即来源于短双歧杆菌(Bifidobacterium brevis)的蔗糖磷酸化酶，分别通过大肠杆菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)制备蔗糖磷酸化酶用于AA-2G的生产。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种土壤来源的革兰氏阳性细菌。与大肠感菌相比，其作为一种更加有吸引力的外源基因表达宿主，其优点包括：不产生任何内毒素、无致病性；被认为是一种GRAS安全菌株；枯草芽孢杆菌只有一层膜，不具有外膜结构，酶的分泌能力较强；营养要求低；遗传背景清晰；已有大量关于其转录和翻译机制、大规模发酵的信息；无显著密码子使用偏好性等等。因为其特有的优势，枯草芽孢杆菌已成为了目前生产各种工业酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的理想宿主菌株。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种利用蔗糖磷酸酶高效制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的重组工程菌及方法，即将短双歧杆菌(Bifidobacterium brevis)来源的蔗糖磷酸化酶基因分别克隆至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌而构建的重组工程菌，并将工程菌应用于制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的方法，实现生物法一步催化转化高效生产AA-2G。

本发明采用的技术方案是：