[发明专利]一种筛选高烟碱烟草品种突变体的方法

权利要求书

1.一种筛选高烟碱烟草品种突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S01、创制烟草突变一代群体：

将待筛选烟草品种的种子通过EMS诱变方法创建M1代植株；

S02、叶面化学突变体的室内筛选：

通过对M1代植株的叶片进行第一特定性检测，选择符合第一设定标准的M1代植株为第一突变株系，并收获M2代种子进行培育；

S03、将由M2代种子的植株分别提取DNA，形成DNA混池；根据NtJAZ1基因序列设计特异性扩增引物，对不同的DNA混池进行扩增和筛选，对每个植株均进行目标基因测序，筛选出NtJAZ1基因突变且失去功能的植株为突变单株；

S04、以M1代植株为轮回亲本，与步骤S03的突变单株进行设定次数的连续回交及自交，利用分子标记进行辅助选择，筛选出NtJAZ1基因纯合的第二突变株系，并利用基因芯片技术对回交后代进行遗传背景选择；

结合烟碱含量、叶面分泌物含量检测，从第二突变株系中筛选出符合要求的植株为高烟碱株系；

S05、将高烟碱株系在不同生态条件的烟区种植，直接进入烟草新品种的田间选育程序；

S06、将田间选育植株进行第二特定性检测，筛选出符合第二设定标准的田间选育植株为高烟碱改良品种。

2.一种筛选高烟碱烟草品种突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、创制烟草突变一代群体：

将待筛选烟草品种的种子通过EMS诱变方法创建M1代植株,并收获相应的M2代种子；

S2、叶面化学突变体的室内筛选：

利用EMS诱变方法处理M2代种子并获得M2代植株，通过对M2代植株的叶片进行第一特定性检测，选择符合第一设定标准的M2代植株为第一突变株系，并收获所述第一突变株系的种子为M3代种子进行培育；

S3、将由M3代种子培育的植株分别提取DNA，形成DNA混池；根据NtJAZ1基因序列设计特异性扩增引物，对不同的DNA混池进行扩增和筛选，对每个植株均进行目标基因测序，筛选出NtJAZ1基因突变且失去功能的植株为突变单株；

S4、以M1代植株为轮回亲本，与步骤S3的突变单株进行设定次数的连续回交及自交，利用分子标记进行辅助选择，筛选出NtJAZ1基因纯合的第二突变株系，并利用基因芯片技术对回交后代进行遗传背景选择；

结合烟碱含量、叶面分泌物含量检测，从第二突变株系中筛选出符合要求的植株为高烟碱株系；

S5、将高烟碱株系在不同生态条件的烟区种植，直接进入烟草新品种的田间选育程序；

S6、将田间选育植株进行第二特定性检测，筛选出符合第二设定标准的田间选育植株为高烟碱改良品种。

3.根据权利要求1或2所述的筛选高烟碱烟草品种突变体的方法，其特征在于，所述EMS诱变方法为：

利用设定质量百分比浓度的EMS处理待处理种子第一设定时间，并使得处理后种子的致死率为50％左右。

4.根据权利要求3所述的筛选高烟碱烟草品种突变体的方法，其特征在于，所述EMS的质量百分比浓度为0.8％，第一设定时间为8小时。

5.根据权利要求1或2所述的筛选高烟碱烟草品种突变体的方法，其特征在于，所述第一特定性检测的方法包括以下步骤：

1)叶面腺毛形态学检测：

筛选长柄多腺头分泌型腺毛的突变体进行标记；

2)叶面组织化学检测：

采取组织化学染色法，利用罗丹明对叶面化学物质中糖脂成分进行染色，通过显微观察，直接筛选分泌物较高的所述突变体；

3)腺毛基因表达检测：

提取叶面腺毛RNA，根据西柏烷合成基因CBT和CYP71D16设计引物进行RT-PCR检测分析，筛选腺毛分泌物生物合成旺盛的叶面所对应的突变株系；

4)腺毛分泌化学成分检测：

采用有机溶剂萃取法，提取叶面分泌物，利用紫外吸收法检测叶面化学成分总量，并判断该叶面化学成分总量是否达到设定标准值，若没有达到设定标准值，则弃用该叶面对应的突变株系；

若达到或超过设定标准值，则进一步用GC/MS法检测西柏烷类腺毛分泌物的含量变化，筛选含量变化高的叶面对应的突变株系留种。