[发明专利]一种表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种表皮生长因子‑溶菌酶融合蛋白及其提高植物中表皮生长因子EGF表达量和制备治疗溃疡或/和伤口愈合药物中的应用，所述融合蛋白是将表皮生长因子EGF和溶菌酶LYZ用连接肽链接构成。本发明通过EGF与溶菌酶融合表达，可以增加EGF的表达量，提高EGF的稳定性；EGF与溶菌酶融合表达后获得的新蛋白同时具备EGF与溶菌酶的生物功能，在伤口或溃疡的治疗方面具有增效作用。

(一)技术领域

本发明涉及一种表皮生长因子与溶菌酶融合蛋白、编码基因及其应用。

(二)背景技术

表皮生长因子(EGF，Epidermal Growth Factor)是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。人类表皮生长因子(hEGF)是一种由53个氨基酸残基和3个分子内二硫键组成的6.2kda多聚肽(Carpenter G etal.J BiolChem.1990)。hEGF主要生物学功能之一是促进上皮细胞和内皮细胞的生成，促进组织修复，它能加速因溃疡和伤口等原因而受损组织的愈合过程(Schultz G etal.J CellBiochem.1991)。hEGF在治疗皱纹、老年斑、雀斑和痤疮方面也很有效。传统上，hEGF从动物尿液中经过复杂的纯化步骤来纯化。然而，该工艺的hEGF收率和纯度较低，不能满足工业生产的需要。基因工程是一种可以大规模生产纯hEGF的方法。近二十年来，hEGF在大肠杆菌、短芽孢杆菌、酿酒酵母和杆状病毒等多种宿主系统中产生。在大肠杆菌中，hEGF的产量达不到工业需要的水平，因为细胞质hEGF倾向于形成包涵体，而包涵体可以被蛋白酶迅速降解，导致hEGF的错误折叠。同时，由于从包合体释放hEGF所需的额外下游处理步骤，使得总体生产成本增加。此外，与真核生物系统相比，由于缺少翻译后修饰，原核系统产生的hEGF具有较低的生物活性。因此，真核表达系统可能是大规模生产高活性hEGF的最好选择。但是目前，在真核系统中，EGF的表达量都非常低，严重限制了利用真核系统成产重组EGF的产业化。比如，在烟草中表达的EGF只占到总可溶蛋白的0.000006％，即20-60pg/mg(Higo etal.BiosciBiotechnol Biochem.1993)。即使在优化后也只在烟草叶片中达到总可溶蛋白的0.3％(Bai,Jie-Ying,et al.Biotechnology letters.2007)，在大豆种子中达到6.7+/-3.1to 129.0+/-36.7μg EGF/g(He,Yonghua,et al.PloS one.2016)。因此，提高EGF在真核表达系统，特别是在植物表达系统中的表达量非常急迫。

溶菌酶(Lysozyme，LYZ)，又称胞壁质酶(muramidase)，其化学名称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase)，是一种稳定的碱性蛋白酶。它可对细菌细胞壁肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺、以及N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键进行水解，促进细菌细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，降低细菌细胞壁的稳定性，导致细胞壁裂解内容物溢出，并最终引起细菌溶解。在与带负电荷的病毒蛋白相互结合的情况下，溶菌酶能够与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐。这种复盐具有使病毒失去活力的特性。研究表明，溶菌酶能够在不破坏其他组织的前提下，有选择地对微生物的细胞壁进行分解。这种特性就使得溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力、促进双歧杆菌等有益菌增殖的独特功效。溶菌酶分为3型：C型、G型和噬菌体溶菌酶。人源溶菌酶(Human lysozyme，hLY)属于C型溶菌酶，由130个氨基酸残基组成，相对分子质量为15kda，其由单核巨噬细胞分泌，在机体内具有非特异性防御作用(Huang,Jianmin,et al.Molecular Breeding 2002)。从自然界中提取人源溶菌酶主要是从人白细胞或人乳中提取，产量低，价格昂贵，无法应用于临床。但是有科学家尝试在水稻种子中表达人溶菌酶，获得的转化体中，溶菌酶蛋白的含量达到了稻米重量的0.6％，占可溶蛋白的45％(Huang,Jianmin,et al.Molecular Breeding.2002)。