[发明专利]一种高效鸭坦布苏病毒病亚单位疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开一种高效鸭坦布苏病毒病亚单位疫苗的制备方法，包括步骤：1)鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的筛选；2)多表位串联基因的构建与人工合成；3)重组质粒pFastHT A‑TBE的构建；4)重组穿梭载体rBacmid‑TBE的构建；5)重组杆状病毒rBV‑TBE的构建。本发明利用杆状病毒表达系统表达的TBE融合表位蛋白可诱导机体产生高水平血清抗体，并能够对鸭子产生较好保护。本发明预测及表达的DTMUV TBE融合表位蛋白具有免疫原性有保护力，可做为一种安全有效的新型鸭坦布苏病毒病候选亚单位疫苗。

技术领域

本发明涉及一种高效鸭坦布苏病毒病亚单位疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus，DTMUV)引起的一种新型传染病，主要引起蛋鸭产蛋量骤然大幅下降，同时以卵巢充血、出血、雏鸭发生神经症状甚至死亡等为主要特征。DTMUV属于黄病毒科、黄病毒属、恩他耶病毒群，为单股正链RNA病毒，长约10990nt，编码一个多聚蛋白，编码3个结构蛋白(C、PrM、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。

DTMUV E蛋白是病毒的主要结构蛋白，在病毒吸附、与宿主细胞膜融合、细胞嗜性、病毒毒力以及病毒组装过程中发挥重要的作用，蛋白表面存在大量的抗原表位，可诱导产生中和抗体。而黄病毒中E蛋白核苷酸序列的同源性较高，在氨基酸序列和结构上比较保守，不同的黄病毒E蛋白之间可能具有相似的结构和功能，因此各个病毒血清间存在一定的交叉反应性。

杆状病毒/昆虫细胞表达系统(Bac-to-Bac expressionsystem)是当前应用较为广泛的表达系统之一。利用该表达系统在昆虫细胞中表达的外源蛋白具有能正确折叠、转录后加工修饰、糖基化，并且生物活性较好且安全性较高。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种高效鸭坦布苏病毒病亚单位疫苗及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用的一种高效鸭坦布苏病毒病亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的筛选：以鸭坦布苏病毒囊膜蛋白基因序列为基础，筛选出2段T细胞表位与8段B细胞表位；

2)多表位串联基因的构建与人工合成：以筛选出的2段T细胞表位与8段B细胞表位多肽氨基酸序列为依据，在两个不同表位间分别引入柔性氨基酸G1y-ser作为柔性肽，串联构成一个连续的开放阅读框，并在DNA序列的两端加NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，合成DNA基因，命名为TBE，将TBE基因连接至pMDl8-T中，命名为pMDl8-T-TBE；

3)重组质粒pFastHTA-TBE的构建：NcoⅠ和XhoⅠ分别对pMDl8-T-TBE、pFastHT A质粒进行双酶切，分别回收载体片段与目的基因片段，用T4 DNA连接酶将目的基因片段连接到杆状病毒表达载体pFastHTA上，然后转化至DH5α感受态细胞中，构建pFastHTA-TBE，将酶切鉴定正确的重组质粒测序；

4)重组穿梭载体rBacmid-TBE的构建：将pFastHTA-TBE转化DH10Bac感受态细胞，37℃培养24～48h，通过蓝白菌落筛选，并提取rBacmid-TBE，以M13通用引物进行PCR鉴定；

5)重组杆状病毒rBV-TBE的构建：将纯化的rBacmid-TBE，利用脂质体LipofectamineTM2000转染Sf9昆虫细胞，提取病毒DNA，PCR鉴定为阳性的重组病毒低剂量感染Sf9昆虫细胞，经2代扩大培养后收获培养上清液，即获得重组杆状病毒rBV-TBE，4℃避光保存。

本发明还提供了一种高效鸭坦布苏病毒病亚单位疫苗，其由上述方法制得。