[发明专利]一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用

说明书

本发明属于电化学传感器技术领域，具体公开了一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用，其工作电极制备方法如下：将T型结构复合物(Ts)、燃料链F、靶序列T混合，得混合液，孵育得扩增产物；将捕获探针固定至金电极表面，再将扩增产物滴加到固定有捕获探针的金电极表面，制得熵驱动的链置换循环放大体系；将亚甲蓝(MB)与DNA纳米片混合反应得到MB‑DNS混合物，然后将DNS混合物滴加到金电极表面，孵育，得到DNA纳米片纳米分子放大检测体系，即完成所述工作电极的制备。本发明成功构建了一种DNS纳米分子和级联T型结构相结合的电化学传感器，用于检测外泌体miRNA，灵敏度高，反应速度快，稳定性和重现性好。

技术领域

本发明涉及电化学传感器技术领域，特别是涉及一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用。

背景技术

外泌体是30-200nm的细胞外小囊泡，通过与细胞质膜的融合释放到外周循环中，包含了各种生物活性物质，如miRNA、蛋白质和DNA，外泌体被赋予独特的抗原提呈和细胞间通讯的生物学功能。研究表明，存在于外泌体中的miRNA(Exo-miRNA)与乳腺癌、胃癌和结肠癌密切相关，并且外泌体miRNA可免受RNase降解，已成为临床早期诊断中重要的肿瘤生物标志物。目前，检测外泌体的常用方法是定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)。然而，这种方法费时费力，因此，开发一种快速和高灵敏度的新方法来准确测量外泌体miRNA尤为重要。

近年来，熵驱动循环反应(EDCR)、催化发夹组装(CHA)和杂交链反应(HCR)等无酶信号放大方法被探索用于miRNA的放大检测。为了明显提高反应速度，参与信号放大传感系统的可扩散反应物被组装在一个紧凑的空间中。例如，Ju等人(Ren，K.；Xu，Y.；Liu，Y.；Yang，M.；Ju，H.A Responsive“Nano String Light”for Highly Efficient mRNA Imagingin Living Cells via Accelerated DNA Cascade Reaction.ACS Nano 2018，12(1)，263-271.)设计了一种定位的HCR，即发夹探针交替结合到滚环扩增(RCA)产生的长DNA链上进行mRNA的检测，与传统的HCR相比，表现出极快的反应速度。类似地，Wei等人(Wei，Q.；Huang，J.；Li，J.；Wang，J.；Yang，X.；Liu，J.；Wang，K.DNA nanowire based localized catalytichairpin assembly reaction for microRNA imaging.Chem.Sci.2018，9(40)，7802-7808)开发了一种用于miRNA成像的定位CHA，其中CHA反应物通过多条单链杂交被固定在组装的DNA纳米线上。

虽然上述传感系统中的局域化的反应底物可以大幅度提高反应速度，但这些策略存在以下缺陷：1)定域底物的构建需要多个组装步骤，导致费时费力；2)可扩散反应物与DNA纳米线的杂交效率在物理条件下可能较低，直接导致定位结构不完全；3)CHA和HCR的固有特性，例如不可接受的电路泄漏和严格的反应条件，即二价金属离子(如Mg2+)总是对分析性能有不利影响，限制了它们在早期肿瘤诊断中的进一步应用。此外，泄漏可能更严重，因为紧凑空间中增加的DNA发夹数量更容易发生非特异性相互作用。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用，基于局域化的T结构熵驱动循环反应和多功能DNA纳米片作为电化学标签，用于快速和高灵敏地检测外泌体miRNA。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种检测外泌体miRNA的电化学传感器的制备方法，所述电化学传感器包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的制备方法包括以下步骤：

(1)金电极表面处理：将裸金电极表面处理干净，备用；

(2)制备扩增产物：将T型结构复合物(Ts)、燃料链F、靶序列T混合，得混合液，孵育，得扩增产物；