[发明专利]一种施氏假单胞菌突变菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明属于微生物技术领域，涉及一种突变菌株及其构建方法和应用。一种施氏假单胞菌突变菌株，该菌株是施氏假单胞菌DSM4166‑TP(nifR)，于2019年12月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19081。本发明的有益效果是：本发明构建了一株施氏假单胞菌突变菌株，该菌株与现有的野生型DSM4166菌株相比，固氮酶合成基因表达水平具有较大幅度提高，产生的固氮酶活性也大大高于野生型DSM4166菌株。本发明的施氏假单胞菌突变菌株可在工业上大规模生产，具有广阔的商业价值。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种突变菌株及其构建方法和应用。

背景技术

施氏假单胞菌DSM4166(Pseudomonas stutzeri DSM4166，之前称为CMT.9.A)是一株具有固氮能力的功能菌株，于1897年从德国高粱(Sorghum nutans)根际中分离。该菌目前已被保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche SammLung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，保藏号为DSM4166。该菌在无氨和微好氧条件下可将空气中的氮气转化为植物可以直接利用的铵。目前该菌株的基因组测序工作已经完成，发现在其基因组上包含一段固氮基因岛(Nitrogen-fixing gene island，Nif)，位于cobs(PSTAA1334)与gshp(PSTAA1391)基因之间，长度为49kb，包含有58个不同的基因，是生物固氮系统进化中功能和结构完整的固氮类型。

由于目前施氏假单胞菌DSM4166的固氮酶活性不高，未达到另人满意的商业化程度，利用基因工程手段，通过对固氮基因簇的精简、高强度启动子替换等手段，进一步人工设计和重构优化生物固氮途径，大幅度提高其固氮能力，力争突破自然固氮极限，达到令人满意的商业化程度。

发明内容

本发明的目的是提供一种施氏假单胞菌突变菌株，该突变菌株与现有的施氏假单胞菌突变菌株相比，具有更强的生物固氮能力。同时本发明还提供了该突变菌株的构建方法和应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供一种施氏假单胞菌突变菌株，该菌株是施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)DSM4166-TP(nifR)，于2019年12月04日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19081。

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明的突变菌株DSM4166-TP(nifR)是将经基因重排和高强度启动子插入重构的固氮基因簇nifR，通过转座的方式插入野生型的DSM4166细菌基因组中而构建出的工程菌株。基于此，本发明还提供了上述突变菌株DSM4166-TP(nifR)的构建方法，包括：

筛选施氏假单胞菌DSM4166中强组成型启动子；

利用筛选出的强组成型启动子重构固氮基因簇nifR，并构建固氮基因簇质粒p15A-cm-nif refactoring；

将接合转移原件oriT和转座原件TnpA插入到所述的固氮基因簇质粒p15A-cm-nifrefactoring；

通过接合转移与转座的方式将重构好的固氮基因簇插入到施氏假单胞菌DSM4166的基因组中。

作为本发明的一种优选方式，所述强组成型启动子的筛选步骤为：

测取P.stutzeri DSM4166在不同培养条件下的生长曲线；

每种培养条件下选取3个时间点进行转录组测序，从转录组数据中挑取表达水平在前5％cut off的基因；