[发明专利]一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备及转化方法

说明书

本发明提供了一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，待芽长出后移植到琼脂培养基中黑暗培养至长苗，将苗的下胚轴切下进行愈伤组织诱导，待胚性愈伤长出后扩繁四到五次，即所述的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体。该方法与传统番木瓜愈伤组织转化相比，通过改良愈伤组织的诱导培养基，愈伤诱导时间显著缩短，并且愈伤状态好利于转化，番木瓜转化效率高。本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。

技术领域

本发明涉及一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备及转化方法，属于转基因技术领域。

背景技术

番木瓜(Carica papaya L.)又称木瓜、乳瓜、万寿果，为热带、亚热带常绿软木质大型番木瓜科多年生草本植物，常绿软木质小乔木。番木瓜与香蕉、菠萝并称为热带三大草本果树，是人们喜爱的果蔬兼药用的热带水果，在我国南方享有“万寿果”和“岭南佳果”的美誉。番木瓜除鲜食外，还可加工成果汁、果酱、蜜饯、腌渍；番木瓜素有很强的分解蛋白质的能力，可制造健胃药、驱虫剂，还可作酒类、果汁的澄清剂和肉类的软化剂。番木瓜是一种具有很高经济价值和药用价值的植物。然而目前在番木瓜生产中遇到了实际性迫切需要解决的问题:番木瓜株性复杂(有雄性株、雌性株和两性株)，并且番木瓜是异花授粉果树，即使通过杂交手段成功选育抗耐病品种，其后代的性状必然严重分离，很难保持其抗病优良性状不变。因此，通过转基因技术培育出稳定、高抗、谱抗，且安全性好的新品种是发展番木瓜生产的当务之急，是防治番木瓜病毒病的根本途径。但是，目前，现有技术中比较缺乏成熟的番木瓜转基因技术，番木瓜转化周期很长，并且体系不是特别稳定，严重制约着番木瓜育种产业的发展。

发明内容

本发明提供了一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备及转化方法，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，待芽长出后移植到琼脂培养基中黑暗培养至长苗，将苗的下胚轴切下进行愈伤组织诱导，待胚性愈伤长出后扩繁四到五次，即所述的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体，此时的愈伤状态利于转化。

作为进一步改进的，所述消毒为在无菌环境中，将番木瓜种子先后经过体积浓度为70～80％的酒精、体积浓度为3～4％的NaClO溶液和质量浓度为0.05～0.15％氯化汞消毒，最后用无菌水清洗数次，这种消毒方式显著抑制了木瓜内生菌的繁殖。

作为进一步改进的，所述浸泡为将番木瓜种子浸泡在体积浓度为18～22％的NaClO溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床3.5～4.5h；然后将番木瓜种子从NaClO溶液中取出，用无菌水清洗数次，浸泡在浓度为0.5～1.5mol/L的KNO3溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床20～26h，番木瓜种子经过KNO3的处理，显著提高了种子的萌发率。

作为进一步改进的，所述抗生素为浓度为450～550mg/L的羧苄青霉素。

作为进一步改进的，所述萌发长芽为将番木瓜种子从KNO3溶液中取出，用无菌水清洗数次，放入含有抗生素的无菌水中，置于28～32℃，110～130rpm摇床，每天更换含有抗生素的无菌水，直至番木瓜种子出芽，这种方法保证了种子萌发过程中不被污染。

作为进一步改进的，所述愈伤组织诱导为当待长出的苗的高度达8～10cm，顶端的两片子叶张开时，取其下胚轴切成8～10mm小段置于K4培养基上培养1个月，优选为将下胚轴切成5mm，然后转到M13培养基上诱导愈伤组织，长出愈伤组织后换成Ci培养基，通过将外植体在三种不同配比的培养基上培养，使得愈伤诱导时间短，状态好，利于转化。