[发明专利]一种肺癌细胞株突变文库及其构建方法

说明书

一种肺癌细胞株突变文库及其构建方法，属于基因突变技术领域。本发明提供了一种肺癌细胞株突变文库的构建方法：1)用CAG‑tTA质粒转染人肺癌细胞株，获得稳定表达且受四环素调控的转录激活因子的Tet‑off细胞株；2)将基因搜寻载体和有效表达转座酶MPB的质粒，共转染步骤1)获得的Tet‑off细胞株，获得全基因组纯合细胞突变体；所述基因搜寻载体的转染剂量为500ng/10⁵个细胞，所述有效表达转座酶MPB的质粒的转染剂量为125ng/10⁵个细胞。本发明可用于肺癌相关基因的筛选。

技术领域

本发明具体涉及一种肺癌细胞株突变文库及其构建方法，属于基因突变技术领域。

背景技术

近年来，肺癌细胞株突变文库的构建方法包括RNAi干扰技术、cDNA文库技术、CRISPR技术和插入突变技术等。RNA干扰技术是近年发展的一项新的基因沉默技术，可利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除或关闭特定基因的表达，借助siRNA表达文库可进行高通量筛选，发现新的功能基因。然而，该技术在设计沉默靶基因的dsRNA时，需提前获知靶基因的序列，无法筛选一些未知基因或序列；另外，RNAi技术只能下调靶基因的表达，无法过表达基因，往往需配合cDNA文库筛选，这也限制了其应用，但仍不能筛选到未知基因或序列。cDNA文库技术和CRISPR技术也需要提前预知靶基因的序列，也只能单向上调或下调基因。插入突变是常利用转座子携带外源DNA序列作为标记，破坏基因的结构而导致突变，可以直接验证个别基因与所筛选性状之间关系，然而人类是二倍体生物，存在两个等位基因，当其中一个等位基因结构破坏而不能正常表达时，而同源染色体上另一个等位基因仍正常表达，以致无法使该基因失活。

发明内容

本发明提供了一种肺癌细胞株突变文库的构建方法，步骤如下：

1)用CAG-tTA质粒转染人肺癌细胞株，获得稳定表达且受四环素调控的转录激活因子的Tet-off细胞株；

2)将基因搜寻载体和有效表达转座酶的质粒，共转染步骤1)获得的Tet-off细胞株，获得全基因组纯合细胞突变体；

所述基因搜寻载体的转染剂量为500ng/10⁵个细胞，所述有效表达转座酶的质粒的转染剂量为125ng/10⁵个细胞；

所述基因搜寻载体包含四环素反应元件、piggyBac转座子、新霉素抗性基因和质粒复制起点，所述四环素反应元件通过两段四环素反应元件拼接得到；所述有效表达转座酶的质粒为MPB。

进一步地限定，步骤1)中所述的人肺癌细胞株为人肺癌A549细胞株。

本发明还提供了上述构建方法获得的肺癌细胞株突变文库。

有益效果

该肺癌细胞突变文库含有全基因组随机突变基因，该种基因突变可通过添加四环素DOX来调控，而且该种调控是一种变阻器式调控，即突变基因的表达水平随添加的四环素DOX浓度变化而变化。本发明可用于肺癌发生、耐药、转移等关键致病基因的筛选。

附图说明

图1Tet-off克隆的筛选，横坐标为Tet-off克隆编号，纵坐标为调控倍数；

图2候选4个Tet-off克隆细胞株受DOX调控特性比较，横坐标为Tet-off克隆编号，纵坐标为调控倍数；

图3#4和#5克隆受DOX变阻器式调控的检测，横坐标为四环素浓度(ng/mL),纵坐标为相对光单位；

图4基因搜寻载体GSV和转座酶mPB共转染量的摸索；

图5GSV插入位点的偏好性，bits代表保守位点。

具体实施方式