[发明专利]一种催化苯乙烯及其衍生物制备手性有机化合物的方法

说明书

本发明属于生物催化领域，具体涉及细胞色素P450酶催化苯乙烯及其衍生物环氧化反应制备手性化合物(R)的方法。具体为采用双功能小分子化合物(Im‑C6‑Phe)促进P450突变体利用H₂O₂催化苯乙烯及其衍生物获得(R)‑对映选择性的苯乙烯氧化物。本发明通过对P450BM3的理性设计，在双功能小分子(Im‑C6‑Phe)的协助下，利用绿色能源H₂O₂作为氧化剂；进而实现P450BM3突变体对底物的高效、选择性的催化得到相应的对映异构体。此方法的应用可以得到一系列利用H2O2的P450BM3突变体；进一步获得较高的(R)‑对映选择性的苯乙烯氧化物。

技术领域

本发明属于生物催化领域，具体涉及一种细胞色素P450酶利用H₂O₂催化苯乙烯及其衍生物环氧化反应制备手性化合物(R)的方法。

背景技术

手性苯乙烯氧化物是一种非常有用的有机化合物合成材料。苯乙烯的不对称环氧化反应是制备该类化合物最直接的方法之一，在过去的几十年中引起了人们的广泛关注。尽管近年来在合成分子催化剂基础上的不对称环氧化反应取得了重大进展。大多数催化体系获得了有价值的(S)-苯乙烯氧化物。例如，在Ti(O-i-Pr)4催化剂作用下，脯氨酸衍生的C1对称手性配体有效地将苯乙烯衍生物转化为(S)-环氧化合物，其ee为96-98％。也出现了少数的(R)-苯乙烯氧化物。例如，著名的雅各布森(Jacobsen)催化剂生成(R)-苯乙烯氧化物的ee仅为57％，当在-78℃进行反应时，该值提高到86％。

在自然界中，在生物催化剂基础上的不对称环氧化反应也取得了重要的进展；其中，苯乙烯单加氧酶(SMO)是最显著的生物催化剂，迄今为止，一种优异的苯乙烯单加氧酶催化苯乙烯环氧化反应，其(S)-苯乙烯氧化物的ee99％。最近，科学家从链霉菌(Streptomyces sp.NRRL S-31)基因组中鉴定出第一种能产生(R)-苯乙烯氧化物的天然SMO，其ee为91％；目前已知最好的苯乙烯氧化物的(R)-对映选择性可达98％，其由含乙烯单加氧酶的分枝杆菌属(Mycobacterium sp)的菌株催化所得，但该菌株能够催化的底物具有局限性。

目前，酶工程技术是生物催化剂改造最有效的手段，比如对细胞色素P450酶的改造。目前，P450突变体是催化苯乙烯不对称环氧化反应上应用最广泛的生物催化剂。例如，Huang等人通过定点突变技术，将P450BM3的A82位和T438位的氨基酸进行双突变，其中A82F-T438F突变体催化苯乙烯的不对称环氧化反应，其(R)-苯乙烯氧化物的ee达到64％；近期，Reets等通过定向进化技术改造P450BM3，使P450BM3突变体催化苯乙烯不对称环氧化反应生成(R)-苯乙烯氧化物的ee提高至96％，但在其催化过程中仍无法摆脱对辅助因子NADPH的依赖。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具体涉及一种细胞色素P450酶利用H₂O₂催化苯乙烯及其衍生物环氧化反应制备手性化合物(R)的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种催化苯乙烯及其衍生物环氧化反应制备手性有机化合物的方法，双功能小分子(Im-C6-Phe)促进P450突变体利用H₂O₂催化苯乙烯及其衍生物获得(R)-对映选择性的苯乙烯氧化物。

细胞色素P450BM3的氧化酶结构域上的第87位苯丙氨酸和第268位苏氨酸处的两个位点突变；这两个位点的氨基酸可相同或不同的突变体为F87A-T268A/I/V/F/L/W、F87V-T268I/V、F87I-T268I/V、F87L-T268I/V和F8G-T268I/V。