[发明专利]一种检测凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法

说明书

本发明公开了一种检测凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法，属于酶活检测技术领域。本发明提供的方法为：将凋落物样品破碎后装到离心过滤管中，添加培养缓冲液低温培养后高速离心并混合滤液定容至一定体积，制备灭活酶液；将酶活性液和灭活酶液依次分别添加酶活性孔和阴性对照孔，再添加4‑MUB‑β‑D‑乙酰氨基葡萄糖苷工作液，在遮光条件下震荡培养；培养后，向所有酶标孔添加Tris终止液；利用多功能酶标仪进行MUB荧光检测；计算乙酰氨基葡萄糖苷酶比酶活。本发明采用离心过滤管，降低了酶液中的干扰物质；优化了反应体系，灵敏度高，酶液耗量少，反应终止后，测试液pH对上机数据没有影响，真实有效反映凋落物中酶活性。

技术领域

本发明属于酶活检测技术领域，更具体地说，涉及一种检测凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法。

背景技术

凋落物分解是森林土壤物质转化的基础，是植物和微生物养分的主要来源，在维持森林生态系统碳及养分循环中起重要作用。微生物是森林凋落物分解的主要贡献者，在凋落物降解的过程中，凋落物上定殖的微生物会分泌各种胞外酶，改变凋落物的组成结构，从而促进凋落物的降解。作为参与凋落物分解最为重要的生物活性物质，酶活性涉及各种生物化学过程，与凋落物的分解直接相关，在很大程度上反映了土壤C、N、P等养分循环状况，且因凋落物类型及环境条件的不同而异。研究凋落物中各种酶类活性在凋落物分解过程的活性动态，对了解森林凋落物分的微观生态过程具有重要意义。

乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52)兼具几丁质内切酶和外切酶的特性，能够将土壤及凋落物中的通过β-1，4-糖苷键连接而成的几丁质多糖水解成几丁二糖、几丁三糖等低聚糖。由于几丁质是自然界中存量巨大的天然多聚物和含氮有机化合物，所以乙酰氨基葡萄糖苷酶在自然界的碳氮循环中起着关键作用，是今后生态研究的热点。因此测定乙酰氨基葡萄糖苷酶活性有助于深入了解土壤碳氮转化循环过程以及微生物氮素营养的获取途径，而提供一种操作便捷、灵敏度高和稳定性好的凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性检测方法是解决问题的关键。

我国凋落物中乙酰氨基葡萄糖苷酶活性测定方法目前还无统一方法及标准，但可以借鉴有关土壤乙酰氨基葡萄糖苷酶活性测定方法。以采用紫外吸收波长定量的高效液相色谱分离法为例，虽然可同时测定包括乙酰氨基葡萄糖苷酶的多个酶活，但是存在粗酶液中胶体对对底物的吸附以及并不能有效反映凋落物自然pH条件下的酶活性等缺点；硝基苯基-β-氨基葡萄糖苷为底物进行酶解的色原底物法为例，也存在数据结果受测试液pH干扰乙酰氨基葡萄糖苷酶活性以及酶液消耗过多等问题。并且由于森林中原有凋落物构成复杂：可能有的表层凋落物没有或者很少有降解微生物定殖，微生物分泌胞外乙酰氨基葡萄糖苷酶少，也有可能有的凋落物已经处于降解末期。这种复杂情况不利于多种样本之间进行比较研究酶活性及其变化差异，因此凋落物酶活性的检测比土壤酶活测定在前期也需要更多人工干预，使之标准化，以利于凋落物降解过程的研究。目前土壤乙酰氨基葡萄糖苷酶测定方法并不适合直接作为凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性测定标准化的操作流程。

综上，目前需要提供一种新的、标准化、快速便捷的凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的检测方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种一种检测凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种检测凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法，包括如下步骤：

1)将培养缓冲液加入剪碎过筛后的待测凋落物，于离心过滤管离心得到酶滤液，将酶滤液进一步稀释制成酶活待测液；

2)将步骤1)中制得的一部分酶活待测液进行加热，使酶灭活，成为灭活酶液；

3)配制梯度浓度的4-甲基伞形酮(MUB)荧光标准物质溶液，采用多功能酶标仪进行荧光检测；