[发明专利]高产松柏醇的酿酒酵母工程菌及其构建和应用

说明书

本发明公开了一种高产松柏醇的酿酒酵母工程菌及其构建和应用。该工程菌以酿酒酵母为出发菌株，过表达ZWF1、ARO4^K229L、ARO7^G229S、ARO8、TYR1、BDH1^{E221S/I222R/A223S}、COMT1、4CL5、CAD、CCR、HpaB、TAL和PhaC基因；其中：ARO4^K229L为ARO4的第229位的赖氨酸突变为亮氨酸；ARO7^G229S为ARO7的第229位的甘氨酸突变为丝氨酸；BDH1^{E221S/I222R/A223S}为BDH1的第221位的谷氨酸突变为丝氨酸，第222位的异亮氨酸突变为精氨酸，第223位的丙氨酸突变为丝氨酸。该酵母工程菌可以通过发酵获得松柏醇。

技术领域

本发明涉及代谢工程和发酵技术领域，特别涉及一种高产松柏醇的酿酒酵母工程菌及其构建和应用。

背景技术

目前，松柏醇尚未有较为稳定的商品化来源。虽然有化学合成的报道，如以乙酰阿魏酸为原料，制得酰氯后，再酯化，最后还原得到，但其总收率仅24.4％；或者以阿魏酸为原料，经酯化，乙酰化，再经还原得到松伯醇，总收率70.2％。但是，这两种方法都需要用到毒性较大的有机试剂，同时消耗价格昂贵的氢化铝锂，限制了这些方法的实用性。此外也有报道尝试在大肠杆菌中异源表达松柏醇的生物合成途径，得到可以生产松柏醇的重组大肠杆菌。然而利用大肠杆菌异源表达需要使用大量的抗生素，增加了耐药性基因进入生态系统的风险，容易导致超级细菌产生。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高产松柏醇的酿酒酵母工程菌。

本发明的另一目的在于提供所述高产松柏醇的酿酒酵母工程菌的构建方法。

本发明的又一目的在于提供所述高产松柏醇的酿酒酵母工程菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高产松柏醇的酿酒酵母工程菌，以酿酒酵母为出发菌株，过表达ZWF1、ARO4^K229L、ARO7^G229S、ARO8、TYR1、BDH1^{E221S/I222R/A223S}、COMT1、4CL5、CAD、CCR、HpaB、TAL和PhaC基因；其中，

所述的ARO4^K229L为ARO4基因的第229位的赖氨酸突变为亮氨酸；

所述的ARO7^G229S为ARO7基因的第229位的甘氨酸突变为丝氨酸；

所述的BDH1^{E221S/I222R/A223S}为BDH1基因的第221位的谷氨酸突变为丝氨酸，第222位的异亮氨酸突变为精氨酸，第223位的丙氨酸突变为丝氨酸。

所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母BY4741。

所述的ZWF1、ARO4、ARO7、ARO8、TYR1和BDH1基因可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到；其中，ZWF1的核苷酸序列如GenBank:NM_001183079.1所示；ARO4的核苷酸序列如GenBank:NM_001178597.1所示；ARO7的核苷酸序列如GenBank:NM_001184157.1所示；ARO8的核苷酸序列如GenBank:NM_001181067.1所示；TYR1的核苷酸序列如GenBank:NM_001178514.1所示；BDH1的核苷酸序列如GenBank:NM_001178202.2所示。

所述的COMT1、4CL5、CAD和CCR基因可以以拟南芥cDNA为模板克隆得到，其中，COMT1的核苷酸序列如GenBank:NM_124796.4所示；4CL5的核苷酸序列如GenBank:AY376732所示；CAD(即CAD5)的核苷酸序列如GenBank:AY302082所示；CCR(即CCR1)的核苷酸序列如GenBank:NM_001332191.1所示。