[发明专利]碱性蛋白酶的突变体及其应用

说明书

本发明公开的碱性蛋白酶突变体，其相对于原始氨基酸序列，其在第113位氨基酸由Ile变为Ala，或更进一步地第140位氨基酸由Ile变为Glu。通过将突变体编码基因分别构建了表达所述突变体的重组菌枯草芽孢杆菌，其发酵上清液在pH7.0条件下的酶活分别为5673 U/mL和6733 U/mL，比表达野生型碱性蛋白酶subC的枯草芽孢杆菌酶活分别提高了130％和154％。

技术领域

发明属于生物技术领域和蛋白质工程领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体蛋白。

背景技术

碱性蛋白酶(alkaline protease)指在碱性条件下（pH在9～11范围内）能够水解蛋白质肽键的酶，其主要成分是一种内切蛋白酶，催化部位为丝氨酸，广泛应用于洗涤剂、食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业。目前所采用的碱性蛋白酶多是经细菌原生质体诱变方法培育的来源于枯草芽孢杆菌2709通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属于一种丝氨酸碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。生产工艺是采用微滤超滤膜分离、喷雾干燥或真空冷冻干燥等先进技术。碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢,具有独特的洗涤效果，是工业用酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年总销售量的 60％左右。而在生产中，尤其是粉状洗涤剂用的颗粒碱性蛋白酶的质量要求为无粉尘、安全卫生；同洗涤剂相容性好；在洗涤剂中稳定性好等。因此，还需要开发性能列好，适用性更强的碱性蛋白酶。

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向编码目的蛋白的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，是改造、优化基因的便捷方案，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。近几年酶的定点突变技术应用主要集中于提高酶的催化活性、改善底物特异性、提高热稳定性、对映立体选择等方面。酶的定点突变技术为酶的结构和功能开辟了崭新的途径。比如，通过使碱性蛋白酶突变而提升其比活性或稳定性等，从而提高其清洁性能的研究(日本专利特开2010-273673号公报、日本专利第5202690号公报)。例如CN109312323A公开了碱性蛋白酶的突变体是将亲本碱性蛋白酶的氨基酸序列中的第294位上的氨基酸残基取代为苏氨酸而获得，因而提高了比活性。CN105176951A以来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶aprE为基础，通过突变获得三种突变体，比亲本的活性提高42％、180％和130％。

因此，在对具体的蛋白进行突变时，其突变位点的选择，突变方向的确定往往具有事先难以预期性或不可预料性，尤其对于碱性蛋白酶，现有技术对其酶的结构与功能关系认知比较有限，因而也就不能事先通过理论分析获得具有预期功能性状的蛋白突变体，而为了能够获得性能向期望方向的突变，需要进行前期探索。

发明内容

本发明针对碱性蛋白酶进行了深入的研究，最终通过找到合适的突变位点和具体的替换氨基酸，由地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) 碱性蛋白酶基因 subC 的成熟肽出发，最终获得酶活力得到显著提高的碱性蛋白酶突变体。

本发明一方面提供一种碱性蛋白酶突变体，是在亲本氨基酸序列为 SEQ ID NO:1的碱性蛋白酶基础上，其第 113 位氨基酸由 Ile 变为 Ala，突变体的氨基酸序列为SEQID NO:2。