[发明专利]使用超低量总RNA的多文库混样测序方法

说明书

本发明公开了一种使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，属于生物技术和分子生物学领域，具体包括以下步骤：微量样本总RNA的提取、起始总RNA的反转录和扩增富集、测序库的建立、利用MinlON纳米孔测序仪进行cDNA测序。本发明提供的测序方法所需最低起始量的样本核酸量可低至10pg‑10ng，相当于1‑1000个单细胞的核酸量，能够实现那些获取大量总RNA困难的稀有样本测序，在稀有样本和特殊样本等多个测序领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术和分子生物学领域，尤其涉及一种使用超低量总RNA的多文库混样测序方法。

背景技术

目前，以Illumina为代表的第二代测序平台测得的短读长仅能覆盖转录本的长度，且存在难以实现依赖计算重构准确的异构体等缺陷，因此纳米孔测序技术，又称第三代或第四代测序技术应运而生。使用纳米孔测序技术不仅没有读长上限的限制，还能实现对整个转录本进行单读长的端到端测序，真正实现了简单、准确的组装并能对高度相似的异构体进行区分，所以新一代的纳米孔测序技术已经成为研究RNA测序的一种新的且更为有效的方式。

目前，RNA测序技术对样本的起始RNA量要求较高，对于那些无法达到最低上样量的样本是无法进行测序分析的，但在许多情况下，例如在生殖发育生物学、干细胞、癌症、考古学、临床诊断等多个研究领域中，都无法获得足够上样数量的总RNA。因为上述研究中均涉及微量且稀有的样本，无法满足目前RNA测序技术中对起始RNA量的需求，这无疑成为阻碍RNA测序这项新技术的进一步应用与发展，因此，本领域迫切需要在传统RNA测序方法的技术之上建立一种针对微量样本的RNA测序方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，该测序方法是将超低量总RNA反转录成cDNA，并将cDNA扩增后连接上不同的条码，然后利用MinlON进行测序，该方法不仅能对低于1ng的总RNA进行测序，还可将不同的总RNA混合在一起共同测序。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，所述方法包括以下步骤：

提取微量样本总RNA，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为10pg-10ng；

将起始总RNA的进行反转录和扩增富集，并对扩增富集后的cDNA进行浓度和质量检测，至cDNA的含量达到50-1000ng；

利用扩增富集后cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用MinlON纳米孔测序仪进行测序。

作为优选，所述微量样本包括单细胞检测样本和多细胞检测样本。

作为优选，所述测序库的建立具体包括以下步骤：

利用末端修复酶处理所述cDNA，通过末端修复反应，得到末端修复cDNA；

在所述末端修复cDNA上通过第一次连接反应连接条码，得到条码-末端修复cDNA后，利用磁珠纯化、回收所述条码-末端修复cDNA，得到纯化后的条码-末端修复cDNA，至检测其回收量≥50ng；

将纯化并检测后的条码-末端修复cDNA混合后，在连接酶的作用下，通过第二次连接反应与测序接头连接，得到连接测序接头的条码-末端修复cDNA；

利用磁珠纯化、回收所述测序连接接头的条码-末端修复cDNA，得到纯化后的连接测序接头的条码-末端修复cDNA，并检测其回收量≥100ng时，建立得到测序库。

作为优选，所述末端修复反应的反应体系为：扩增富集后的cDNA50μl、反应缓冲液7μl、末端修复酶3μl，共计60μl；反应条件为：在20℃条件下反应30min，然后在65℃条件下反应30min。