[发明专利]基于希尔伯特变换的结构照明快速三维彩色显微成像方法

说明书

本发明涉及一种基于希尔伯特变换的结构照明快速三维彩色显微成像方法，只需在样品的每一个焦平面上采集两幅任意相移差的原始图像便可以重构出全彩色光切片图像，图像采集量减少了1/3，图像重构时间减少了约28％。

技术领域

本发明涉及一种结构照明显微系统，可以实现高速彩色三维层析成像，可广泛应用于生物学、医学、材料科学及微电子学等领域的研究。

背景技术

色彩信息是描述物体特征的一个重要物理量，三维物体彩色层析成像技术是获取物体表面形态特征的重要手段，也是真实物体三维数字化的基础。以激光共聚焦扫描显微镜为代表的点扫描显微成像技术具有三维层析成像能力，结合多通道融合技术，可以获得样品表面荧光标记物的色彩信息，进一步提高了成像的对比度和解析度，但是受制于带通滤光片的有限带宽，无法复原样品的真实全彩色信息，目前仅应用于生物医学显微成像领域。条纹投影法和白光干涉法是较为成熟的三维物体表面成像与测量技术，在工业检测、动植物化石复原、医学测量等领域得到了广泛的应用，该方法的优点在于轴向测量精度高,但是系统对外界环境的要求非常苛刻,微小的震动就会对测量结果造成较大的影响。这两种技术结合三维贴图技术(3D mapping)都可以近似得到三维物体的表面颜色信息，但是贴图技术的缺点是图象畸变大而且分辨率不高。受到相位解包裹算法的限制，条纹投影法和白光相移干涉法对于表面有复杂突变结构的物体都不适用。

结构照明显微(Structured Illumination Microscopy,SIM)是一种宽场显微技术，可以实现超分辨成像和三维光切片成像。光切片SIM由牛津大学的Neil等人提出，其基本原理是：宽场显微由于显微物镜有一定的景深，因此CCD(Charge Coupled Device,电荷耦合器件)相机得到的图像实际上是像面信息和非像面信息的叠加。传统的光切片SIM使用高空间频率的正弦结构光场照明样品，使用CCD等面阵相机采集三幅固定相移差的图像并通过RMS(Root Mean Square,均方根)算法重构出一幅去除离焦背景的光切片图像，再通过轴向扫描即可实现三维成像。实验过程中的环境震动往往会带来不确定的相移差，进而造成重构图像质量的大幅下降，另外，大量原始图像的采集进一步限制了SIM三维成像的速度，同时对计算机存储空间和图像处理能力提出了更高的要求。为了减少原始图像的采集量，中科院西安光机所Zhou等人于2015在《Plos One》上发表了一种基于希尔伯特变换的快速SIM三维成像方法，只需采集两幅任意相移差的原始图像便可以重构出一幅光切片图像，不仅减少了原始图像的采集量，图像重构速度也有了大幅提升。尽管如此，SIM技术仍然只能获取单色的三维图像，无法将色彩斑斓的样品真实记录并显示。2015年，中科院西安光机所的Qian等人在《Sci.Rep》提出了基于HSV(Hue(色相),Saturation(饱和度),Value(明度)空间的彩色SIM三维成像方法。该方法利用的光学系统如图1所示，包括照明光源1、设置在照明光源光路上的分光棱镜2、设置在分光棱镜2的反射光路上的结构光产生器3、设置在分光棱镜2的透射光路上的透镜4、设置在透镜光路上的分光镜5、设置在分光镜5上方光路上的显微物镜6和载物台7、设置在分光镜5下方光路上的反光镜8和筒镜9、设置在筒镜后方的CCD相机10，CCD相机10为彩色CCD相机；照明光源1为非相干单色LED光源或白光LED光源；结构光产生器3为数字微镜器件DMD；分光镜5为长波通分光镜或者50:50宽带分束器；

该方法具体为彩色CCD相机采集三幅固定相移差的原始彩色图像，将原始彩色图像转换至HSV空间，并在相应的通道利用RMS算法进行光切片处理，随后将处理完成的结果转换至RGB空间进行显示，详见算法流程如图2所示。虽然该方法克服了传统RGB(Red(红)，Green(绿)，Blue(蓝))空间三通道之间相互串扰的问题，首次利用SIM技术实现了样品的全彩色三维光切片成像，这一方法能够复原样品表面的全彩色信息且不会产生色彩偏差，并成功应用于了微电子科学、动物学、植物学等领域以及昆虫结构色的研究中。然而该方法需要采集三幅固定相移差的原始图像，并且需要在HSV空间和RGB空间进行两次转换，对于需要视场拼接的大尺寸样品而言，图像采集数据量大，图像处理算法繁琐。