[发明专利]检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用方法

说明书

本发明涉及病菌检测技术领域，具体公开一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用方法。所述引物和探针的序列为：上游引物：5′‑GTGGACATGTCCGTGCGCAAGTTCGTGGTG‑3′；下游引物：5′‑AGGCGTGGTAGCGGTAGTGCGTGCCGTCGAGGTT‑3′；所述探针的序列为：5′–CGGCCGGGACGACGCCGCGAACAACACTAAGCT‑THF‑CTCATCGTGGACGACAC‑3′。本发明引物和探针的组合用于对羊口疮病毒的实时荧光RPA检测，兼具特异性高、敏感性好、准确性高以及耗时短的优点。

技术领域

本发明涉及病菌检测技术领域，尤其涉及一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用方法。

背景技术

羊口疮又称传染性脓疱，是由羊口疮病毒(ORFV)引起的一种急性接触性传染病，易感于羔羊。羊口疮不仅会交叉传染给其他牲畜，也会导致人的感染，是一种人畜共患病。该病以羊口唇、舌、鼻、乳房等处形成水疱、脓疱、丘疹、溃疡并干结形成疣状厚痂为主要特征。ORFV可以在体内长期存活，感染动物持续排毒。羊口疮对国内外绵羊和山羊养殖业造成了巨大的经济损失，早期、快速和有效诊断是预防和控制羊口疮疫情所必须的重要手段。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种操作简便、反应快速、特异性强、灵敏性高的核酸等温扩增技术，可在短时间内完成扩增检测，并且可以通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光信号检测或侧流层析试纸条(LFS)等不同方式实现对RPA结果的监测。

ORFV的传统检测方法，如病毒分离、抗原捕获ELISA等，存在费时费力、灵敏性低、对操作人员和环境要求高等缺点，无法在基层广泛开展。目前对ORFV的检测，主要依赖于分子检测方法，如PCR、real-time PCR和LAMP方法。RT-PCR和实时荧光RT-PCR方法主要应用于装备良好的实验室，需要精准昂贵的PCR设备和经过严格培训的技术人员，因此不适用于经济欠发达地区装备较差的实验室，更不适用于野外现场检测。目前，real-time PCR方法在已经得到了应用广泛，能够在几小时内给出检测结果，但是该方法需要昂贵的荧光PCR设备，同时临床样品需要在一定的冷链条件下运输到实验室，需要较长的时间，从而造成检测结果的推迟，进而影响对发生的羊传染性脓疱病疫情采取进一步的有效措施。因此，若能建立ORFV的RPA检测方法，则对预防和控制羊口疮病疫情具有重要意义。

但是RPA检测方法对引物和探针的要求较为苛刻，且ORFV的临床症状及病变特征与山羊痘病毒、口蹄疫病毒O型、A型和亚洲I型、小反刍兽疫病毒和羊流感病毒相似，仅通过临床症状和病理变化中非常容易误诊，造成较大的经济损失或者疫情的扩散等，因此快速、敏感、特异性强的检测方法对于该病防控十分重要。

发明内容

针对现有羊口疮病毒(ORFV)的检测方法存在检测方法复杂、耗时长、检测条件要求苛刻及检测效率低的问题，本发明提供一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针，所述引物的序列为：

上游引物：5＇-GTGGACATGTCCGTGCGCAAGTTCGTGGTG-3＇；

下游引物：5＇-AGGCGTGGTAGCGGTAGTGCGTGCCGTCGAGGTT-3＇；

所述探针的序列为：5′-CGGCCGGGACGACGCCGCGAACAACACTAAGCT-THF-CTCATCGTGGACGACAC-3＇。

优选的，在所述探针序列中THF的5′端一侧与其最接近的T碱基上标记荧光基团，THF的3′端一侧与其最接近的T碱基上标记淬灭基团；对所述探针序列的3′末端进行封闭修饰。