[发明专利]基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸及其制备方法

权利要求书

1.基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸，包括支撑板及由样品端到手柄端依次设置于支撑板上的样品垫、金标垫、检测膜和吸水垫，样品垫和金标垫上设有样品垫保护膜，吸水垫上设有手柄端保护膜，其特征在于：所述金标垫吸附胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb，检测膜上的检测线T为盐酸克伦特罗小分子CL与牛血清白蛋白BSA的偶联物BSA-CL印迹，检测膜上的质控线C为抗BSA蛋白兔源多克隆抗体pAb印迹；

所述盐酸克伦特罗小分子CL与牛血清白蛋白BSA的偶联物BSA-CL由以下方法制备得到：采用重氮偶合反应制备盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物，将5mg盐酸克伦特罗CL溶解于4mL、0.01mol/L的稀盐酸中，加入10mg亚硝酸钠，在4℃条件下搅拌6h得到CL溶液，将20mg牛血清白蛋白BSA提前溶解于2mL、0.1mol/L、pH 8.6的磷酸盐缓冲液PBS中，并将其加入到上述CL溶液中，在4℃条件下再次搅拌6h，将获得的溶液对0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液作透析后，4000r/min离心10min，收集上清液即为BSA-CL偶联物，分装后保存于-20℃，待用于羊驼免疫或检测线印制；

所述抗BSA蛋白兔源多克隆抗体pAb由以下方法制备得到：

(1)兔抗牛血清白蛋白多克隆抗体的制备：以弗氏完全佐剂乳化牛血清白蛋白BSA抗原，以200μg/只的剂量通过背部皮下多点注射2.0kg健康新西兰兔，进行首次免疫，间隔3周后，以弗氏不完全佐剂乳化BSA抗原分别进行第二次、第三次和第四次免疫，最后一次加强免疫2周后，采集酶联免疫吸附试验中效价最高的兔全血，以4000r/min离心20min分离高免血清；

(2)兔抗BSA蛋白多克隆抗体IgG的提取：以辛酸-硫酸铵法从高免兔血清中提取IgG，取2mL高免兔血清，向其中加入4mL、0.06mol/L、pH 5.0的乙酸钠缓冲液，以0.1mol/L的盐酸溶液调节至pH 4.5，于室温搅拌下，逐滴加入90μL辛酸，于4℃静置2h，15000r/min离心30min，弃沉淀，在离心上清中加入1/10体积0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液，以0.1mol/L氢氧化钠溶液调节至pH 7.4，于冰浴条件下加入饱和硫酸铵至其终质量浓度为45％，4℃静置2h，10000r/min离心30min，弃上清，以0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液重悬沉淀，对0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液透析后，收集所纯化的兔抗BSA蛋白多克隆抗体IgG，用于检测试纸质控线C印迹的印制；

所述胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb由以下方法制备得到：

(1)抗盐酸克伦特罗纳米抗体的制备

(1.1)盐酸克伦特罗-卵清蛋白偶联物OVA-CL的制备

采用重氮偶合反应制备盐酸克伦特罗-卵清蛋白偶联物，将5mg盐酸克伦特罗CL溶解于4mL、0.01mol/L的盐酸溶液中，加入10mg亚硝酸钠，在4℃条件下搅拌6h得到CL溶液，将20mg卵清蛋白OVA提前溶解于2mL、0.1mol/L、pH 8.6的磷酸盐缓冲液PBS中，并将其加入上述CL溶液中，在4℃条件下再次搅拌6h，将获得的溶液对0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液作透析后，4000r/min离心10min，收集上清液即为OVA-CL偶联物，分装后保存于-20℃，待用于纳米抗体筛选；

(1.2)羊驼免疫与采血

首免时，通过羊驼颈部淋巴结部位注射400μg的BSA-CL与弗氏完全佐剂混合液，两周后，将BSA-CL与弗氏不完全佐剂混合乳化，同上进行第二次免疫，共进行4次免疫，颈部静脉采血，以免疫印迹Western blot检测抗体，以OVA-CL偶联物作为包被抗原建立的间接ELISA测定抗体效价，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，纯化mRNA，并经反转录合成第一链cDNA；

(1.3)噬菌体肽库的制备

利用特异扩增羊驼IgG2和IgG3重链抗体可变区的引物进行PCR反应，获得长度450bp的DNA片段，通过限制性内切酶Sac I和Spe I对目的基因进行酶切并将其克隆至pComb3XSS噬菌粒载体，连接产物电转化TG1感受态细胞得到可能包含编码羊驼全部重链抗体可变区基因的重组噬粒库，随机挑选20个单菌落，提取质粒进行双酶切鉴定，使用辅助噬菌体M13KO7感染上述细菌文库，以使细菌中的噬粒DNA包装成完整的噬菌体，完成噬菌体拯救，释放重组噬菌体，获得噬菌体展示文库，利用Western blot确定VHH-pIII融合蛋白的表达，使用固相化的OVA蛋白和BSA蛋白对噬菌体文库进行预处理，再以固相化的OVA-CL偶联物抗原筛选噬菌体展示库，筛选过程以5wt％BSA和5wt％OVA作封闭液，经过3-5轮的“吸附-洗脱-扩增”过程，获得与CL小分子半抗原高特异性、高亲和力结合的重组噬菌体克隆；

(1.4)噬菌体文库VHH-pIII蛋白表达的检测

将噬菌体文库与适量上样缓冲液混匀，煮沸15min后作为样品进行SDS-PAGE，转移至PVDF膜，以辣根过氧化物酶HRP标记的小鼠抗M13 pIII单克隆抗体作为反应抗体于37℃反应1小时，通过增强型化学发光法曝光检测反应信号；

(1.5)阳性噬菌体克隆的ELISA鉴定

以碳酸盐缓冲液将OVA-CL偶联物抗原或OVA蛋白包被至96孔酶标板，4℃过夜，以5wt％脱脂奶于37℃封闭2小时，以PBST溶液即PBS+0.05wt％Tween-20洗涤三次，4℃条件下3000r/min离心15min收集过夜培养的菌液上清，加入酶标板，37℃孵育1小时，之后加入辣根过氧化物酶HRP标记的小鼠抗M13 pIII单克隆抗体，37℃孵育1小时，加入TMB底物缓冲液显色，于酶标仪上读取OD₄₅₀值；

(1.6)纳米抗体的原核表达与纯化

将最后一轮筛选得到的噬菌体感染TG1感受态细胞，挑取单菌落，提取噬粒DNA，进行双酶切分析，将阳性单菌落噬菌体粒进行测序，并对氨基酸序列进行比对分析，鉴别重复序列及重链抗体可变区标志性的半胱氨酸残基，获得两种重复序列，分别命名为VHH37和VHH64，将编码纳米抗体的DNA片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+)中，构建重组表达质粒pET28a-VHH37和pET28a-VHH64，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在15℃，以0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导蛋白表达8小时，以Ni-NTA亲和层析和分子排阻色谱纯化重组蛋白；

(2)纳米抗体的胶体金标记

(2.1)胶体金纳米颗粒的制备：向500mL洁净的锥形瓶中分别加入100mL超纯水和1mL1％w/v的氯金酸溶液，加热煮沸，在搅拌状态下迅速加入1mL新鲜配制的1％w/v柠檬酸钠溶液用作还原剂，煮沸3min时溶液颜色由黄色变为紫红色，再次煮沸2min后停止，待溶液冷却至室温，以超纯水将溶液体积补充至100mL，以0.2mol/LK₂CO₃调节pH至9.0，4℃避光保存；

(2.2)最适标记蛋白浓度的确定：取待标记的纳米抗体对20mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液于4℃过夜透析，在12孔微孔板中预先加入25μL超纯水，稀释待标记的纳米抗体，留超纯水对照孔，向各孔中加入125μL上述制备的胶体金纳米颗粒溶液，室温静置5min后向各孔中加入125μL、1mol/L的NaCl溶液，发现各孔颜色随纳米抗体浓度的降低而由红色变为蓝色，以颜色未变蓝的纳米抗体最高稀释度对应浓度的120％作为胶体金颗粒标记时的最适蛋白浓度；

(2.3)盐酸克伦特罗小分子特异性纳米抗体的胶体金标记：取2mL稀释至最适标记浓度的纳米抗体，迅速加至10mL、pH 9.0的胶体金溶液并充分混匀，室温孵育10～15min，加入1/10体积含10％w/v牛血清白蛋白BSA的20mmol/L硼酸钠溶液，迅速混匀，室温作用10～15min，在4℃条件下，以15000g离心30min，弃上清，以含1％w/v BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬沉淀，同上离心，弃上清，重复洗涤1次，以1mL含1％w/v BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬沉淀，即为胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb，4℃避光保存，用于金标垫的喷附。