[发明专利]基因工程化大肠杆菌及褪黑素的生产方法

说明书

本发明公开了一种基因工程化大肠杆菌及褪黑素的生产方法。本发明的基因工程化大肠杆菌包含N‑乙酰转移酶基因和O‑甲基转移酶基因，且所述N‑乙酰转移酶基因和O‑甲基转移酶基因能够在所述大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的N‑乙酰转移酶和O‑甲基转移酶。本发明利用基因工程化大肠杆菌生产褪黑素，反应条件温和。

技术领域

本发明涉及一种基因工程化大肠杆菌及褪黑素的生产方法。

背景技术

褪黑素是由哺乳动物大脑中的松果体合成的一类具有生物活性的物质，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺。从结构上看，褪黑素是一种色氨酸衍生物，具有1个吲哚母环、1个侧链乙酰胺基团和1个芳环取代甲氧基。

在制药与保健品领域，褪黑素作为一种内分泌激素，可以通过调节昼夜节律作用，从而改善人类睡眠、延缓衰老。在农业中，褪黑素的用途也十分广泛。外源添加的褪黑素可以促进植物种子发芽和幼苗生长。此外，褪黑素还可以刺激植物免疫系统，提高植物抗逆性。

通常，褪黑素可以通过复杂的化学方法合成。例如，CN110229092A公开了一种化学合成褪黑素的方法，以5-甲氧基吲哚、碳酰氯和氢化铝锂为原料通过多步反应制备得到褪黑素。又如，CN104496882A公开了一种褪黑素的合成方法，由丙二酸二乙酯与丙烯腈为原料，经过加成、酯的氨解、偶合、重排、酰胺的水解、脱羧及酰化等步骤得到褪黑素。化学合成法步骤繁琐、污染大且得率底。

此外，褪黑素还可以从动植物组织中提取。CN109258464A公开了一种通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法。将新疆雪莲愈伤组织在黑暗环境中预处理，然后将预处理得到的新疆雪莲愈伤组织在低气压环境中进行光照培养而获得褪黑素。动植物组织提取法存在原料供应少、提取率低的问题。

近年来，生物催化方法取得快速进展，其具有工艺简单、生产周期短、易于放大等优势，有望成为大规模生产褪黑素的理想途径。但是，现有技术中缺少相关途径的探索和研究。本领域内仍然需要生物合成褪黑素的新方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种基因工程化大肠杆菌，其具有产生N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶的能力。本发明的另一个目的在于提供上述基因工程化大肠杆菌的制备方法。本发明再一个目的在于提供一种褪黑素的生产方法，其利用上述基因工程化大肠杆菌进行褪黑素的微生物合成。

大肠杆菌属于埃希氏菌属，革兰氏阴性菌，是人肠道的普遍寄生菌。它可以在很多类型的培养基上生长，繁殖速度快，一般对人无毒无害。大肠杆菌的基因组约为4.6MB，属于人类最早测序的生物之一。

本发明发现将来自于人源基因组的N-乙酰转移酶和来自于水稻基因组的O-甲基转移酶基因转化到大肠杆菌进行表达，产生具有活性的N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶，从而可以将底物血清素转化为褪黑素。至少基于上述部分发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

一方面，本发明提供一种基因工程化大肠杆菌，其包含N-乙酰转移酶基因和O-甲基转移酶基因，且所述N-乙酰转移酶基因和O-甲基转移酶基因能够在所述基因工程化大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶。

本发明的基因工程化大肠杆菌表示对常规的大肠杆菌通过基因重组技术改造得到的菌株。根据本发明的一个实施方式，通过基因重组技术在那些不具有或缺少N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶活性的野生型或其它人工改造大肠杆菌中引入外来物种的基因来使这些基因表达，从而产生或带来增量的N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶活性，从而获得基因工程化大肠杆菌。优选地，常规的大肠杆菌可以为大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655，其可购自ATCC(保藏编号ATCC700926)。这些大肠杆菌属于市售产品，因而不需要额外的保藏证据及遗传资源登记资料。