[发明专利]一种减少核蛋白抽提物EMSA实验假阳性结果的方法

说明书

本发明涉及一种减少核蛋白抽提物EMSA实验假阳性结果的方法，属于分子生物学技术领域。本发明利用核蛋白抽提物进行经典EMSA实验；对生物素标记探针使用量进行梯度实验，确定生物素标记探针最优使用量；采用生物素标记探针最优使用量，进行核蛋白抽提物上样量梯度实验，得到核蛋白EMSA实验的核酸蛋白复合物目的条带。本发明方法将目的条带精准定位，降低了经典EMSA技术的假阳性率，减少后续结果分析的工作量，提高了实验结论的可靠性。

技术领域

本发明涉及一种减少核蛋白抽提物EMSA实验假阳性结果的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

凝胶迁移阻滞实验（ELectrophoretic MobiLity Shift Assay，EMSA）是一种鉴定DNA与蛋白质或RNA与蛋白质之间，是否存在相互作用的技术方法。EMSA作为一种经典的分子生物学技术，由于其可操作性强，在当前的细胞生物学、遗传学及其他生物医学科研领域中使用广泛。这项技术是基于DNA/RNA与蛋白质形成的核酸蛋白复合物，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中迁移率的差异，来判断核酸序列是否结合了某种转录因子。当核转录因子或细胞核蛋白抽提物与人工合成的特异的DNA/RNA结合后，核酸蛋白复合物在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率将小于未结合核蛋白和转录因子的核酸探针。实验结果可以证明DNA或RNA特定区域的功能特点和生物学意义。

当前开展EMSA实验，转录因子的制备一般有两种途径：第一种途径是直接从试剂公司订购预测的纯化转录因子。但由于订购的转录因子是运用计算程序预测得到，因此准确性由于算法不同而差异较大，其次采购的送货周期较长，最后额外花费较大。如果运用订购的纯化转录因子开展EMSA实验，通常需要订购多种预测的转录因子，实验周期长且成本高昂。另一种途径是直接在目的细胞系中，通过试剂盒来抽提核蛋白复合物替代预测的转录因子。由于该方案的提取试剂盒廉价易得，并且整个提取实验过程操作简便，提取后的核蛋白也较为可靠，在目前的科学研究中广泛使用。

但是，运用核蛋白抽提物进行EMSA实验，也存在诸多不足之处。由于核蛋白抽提物中，所包含的细胞核成分复杂，因此在EMSA实验结果中，会得到大量的非特异性结合条带，容易造成EMSA实验的假阳性结果。

利用核蛋白抽提物进行EMSA实验时，显影后有多种结合条带导致假阳性结果。出现假阳性的结果既也不利于实验结果的分析判断，也会影响整个实验结论的可靠性。因此如何在多种结合条带中，寻找到真实的目的条带，对实验结果分析及后续实验安排，起到至关重要的作用。

发明内容

本发明针对现有利用核蛋白抽提物进行EMSA实验时，实验结果出现假阳性的技术问题，提供一种减少核蛋白抽提物EMSA实验假阳性结果的方法。本发明在不增加实验预算的前提下，在EMSA经典实验基础上增加对生物素标记探针使用量梯度实验，以及核蛋白抽提物上样量梯度实验，可以有效减少实验的假阳性结果。

一种减少核蛋白抽提物EMSA实验假阳性结果的方法，具体步骤如下：

（1）利用核蛋白抽提物进行经典EMSA实验；

（2）对生物素标记探针使用量进行梯度实验，确定生物素标记探针最优使用量；

（3）采用步骤（2）生物素标记探针最优使用量，进行核蛋白抽提物上样量梯度实验，得到准确的核酸蛋白复合物的目的条带。

进一步地，所述步骤（2）实验体系为20mL，生物素标记探针使用量的相邻梯度差值为1~20fmoL；阴性对照组未添加核蛋白抽提物，阳性对照采用经典EMSA实验中成功实验组。

进一步地，所述步骤（2）生物素标记探针使用量梯度实验的生物素标记探针使用量为 10~200fmoL，优选生物素标记探针使用量为 10~50fmoL；