[发明专利]一种结合双向凝胶电泳和质谱鉴定糖蛋白糖链结构的方法

说明书

本发明公开了一种结合双向凝胶电泳和质谱鉴定糖蛋白糖链结构的方法。所述方法包括以下步骤：S1、对生物样本中的糖蛋白进行特异性富集并通过双向凝胶电泳进行分离，根据目标糖蛋白的分子量和等电点选定目标糖蛋白异构体凝胶斑点；S2、使用双向凝胶电泳蛋白印迹和质谱对选定的目标糖蛋白异构体凝胶斑点进行确认；S3、对步骤S2中确认了的目标糖蛋白异构体凝胶斑点进行胶内酶解和质谱分析，鉴定其肽段序列和糖链结构。本发明适用于各种蛋白翻译后修饰(糖基化，泛素化和乙酰化等)生物标志物异构体和修饰体的分离以及结构鉴定，可以显著提高翻译后修饰蛋白作为诊断标志物的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明涉及糖蛋白质组学领域，具体涉及一种结合双向凝胶电泳和质谱鉴定糖蛋白糖链结构的方法；更具体是涉及一种分离鉴定目标糖蛋白异构体并鉴定其糖链结构的新方法。

背景技术

糖基化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一，其涉及许多关键的细胞过程，包括细胞识别和粘附，免疫细胞运输和致癌作用等。糖基化修饰主要发生在内质网和高尔基体，主要过程是在糖基转移酶作用下将糖链转移至蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键，经过一系列转运、糖链末端的剪切、修饰和岩藻糖化或者唾液酸化等，完成糖基化蛋白质的组装。目前，研究较多的为N-糖蛋白和O-糖蛋白，其中N-糖蛋白尤为受关注。N-糖苷键型主要有高甘露糖型、复合型和杂合型三类寡糖链。

组织和体液(血液、尿液和唾液等)中含有数千种蛋白质，其中蕴含的糖蛋白往往是潜在的疾病诊断生物标志物。美国食品和药品管理局(FDA)批准的大多数癌症生物标志物都是糖蛋白(J.A.Ludwig，J.N.Weinstein,Biomarkers in cancer staging，prognosisand treatment selection，Nature Reviews Cancer 5(11)(2005)845-56.)。由于糖链结构的异质性，特定糖蛋白生物标志物的一种或几种糖型以及聚糖结构的临床诊断特异性显著高于糖蛋白自身。但是，目前关于糖蛋白生物标志物的研究主要集中于糖蛋白的差异表达水平上，同时，绝大多数糖蛋白生物标志物的糖链结构都是未知的，导致其用于癌症诊断和预后评价的灵敏度和特异性较低。