[发明专利]一种利用古菌分子标记OTU69快速检测城市搬迁地土壤全汞含量的方法

说明书

本发明公开了一种利用古菌分子标记OTU69快速检测城市搬迁地土壤全汞含量的方法。本发明提供了一种DNA分子(探针)，如序列表的序列1所示。本发明还保护所述探针在检测或辅助检测土壤全汞含量中的应用。本发明还保护所述探针在比较不同地块的土壤全汞含量中的应用。采用本发明提供的方法检测土壤全汞含量或比较不同地块的土壤全汞含量，具有如下优点：样品需求量小，无需前处理，所需时间短，人力成本低，可以实现对大批量样品的快速自动化检测。本发明对于土壤样品的测评具有重要应用推广价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用古菌分子标记OTU69快速检测城市搬迁地土壤全汞含量的方法。

背景技术

随着城市化的快速发展，目前我国城市，尤其是特大城市，已进入“城市再开发”为主导的城市发展阶段，城市搬迁地大量出现，在东部沿海经济发达地区的城市尤其明显。以上海为例，建成区范围内80％-90％的建设绿地都是在城中村拆迁、旧工厂搬迁等地块上开展的，对其土壤质量进行科学客观的监测和评价，是进行城市搬迁地生态修复和园林绿化的前提和重要参考依据。

目前对城市搬迁地土壤质量指标的检测主要是沿用传统的理化检测方法，样品需求量大，样品前处理过程复杂、周期长，尤其所需要的人力资源成本较高，难以实现对大批量样品的快速检测。土壤微生物对土壤环境的变化具有综合性、敏感性和功能性的特点，探索通过检测特定微生物类群的丰度来实现对城市搬迁地土壤质量指标的快速和自动化检测技术具有重要的现实意义。

汞元素是对人体毒害最大的重金属之一，属于129种优先控制污染物之一。土壤中的汞主要来源于：1)土壤母质，土壤母质中的汞是最基本的来源，原生岩中汞元素的含量，直接决定着土壤中汞的含量；2)大气沉降，大气中的汞进入土壤后，绝大部分迅速被土壤中粘土矿物和有机物吸附或固定，富集于土壤表层；3)直接污染，主要包括工业生产废料和城市生活垃圾的堆放，不合理地施用含汞的肥料和农药以及灌溉等。汞及其化合物具有很强的神经毒性和致畸作用，对生态环境和人类健康构成严重威胁，土壤汞污染问题已逐步受到重视。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用古菌分子标记OTU69快速检测城市搬迁地土壤全汞含量的方法。

本发明还提供了一种检测土壤全汞含量的方法(方法甲)，包括如下步骤：

以土壤样品的总DNA为模板，进行实时荧光定量PCR；实时荧光定量PCR的扩增引物对由序列表的序列4所示的引物524F-10-ext和序列表的序列5所示的引物Arch958R-mod组成；实时荧光定量PCR的探针的核苷酸序列如序列表的序列1所示；

实时荧光定量PCR获得Ct值；根据Ct值计算拷贝数，通过土壤样品中的拷贝数含量计算得到土壤样品中的全汞含量。

实时荧光定量PCR的探针为Taqman探针。所述Taqman探针的5’末端具有荧光基团，3’末端具有荧光淬灭基团。所述荧光基团具体可为FAM。所述荧光淬灭基团具体可为TAMRA。

所述拷贝数为所述探针的靶标片段的拷贝数。

通过土壤样品中的拷贝数含量计算得到土壤样品中的全汞含量的实现方法为：将土壤样品的拷贝数含量代入线性方程，得到土壤样品的全汞含量。

线性方程为：y＝-0.1811x+0.6508；y代表全汞含量，单位为mg/kg；x代表拷贝数含量，单位为×10⁷拷贝数/g。线性方程的R²＝0.959。

根据Ct值计算拷贝数的方法为：将Ct值代入标准曲线方程，得到拷贝数。

所述标准曲线方程的制备方法为：将序列表的序列2所示的DNA分子与pMD18-T载体连接，得到OTU69标准品质粒；采用OTU69标准品质粒制作以拷贝数的对数为自变量且以Ct值为因变量的标准曲线方程。拷贝数的对数为拷贝数以10为底的对数。