[发明专利]测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法

权利要求书

1.一种测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，其特征在于：采用分光光度计测定平菇样品的吸光值，通过该吸光值计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性，具体步骤如下：

第一步，称取平菇样品于无菌研钵中，向无菌研钵中快速加入3～10mL预冷的pH=6.1磷酸缓冲液，低温研磨，将研磨后的平菇样品浆液离心，弃沉淀，得到含有吲哚乙酸氧化酶的样品提取液；

第二步，称取吲哚乙酸于烧杯中，用无水乙醇溶解后转移至容量瓶中，然后用蒸馏水定容，混匀，得到吲哚乙酸贮备液；将吲哚乙酸贮备液稀释得到不同浓度的吲哚乙酸标准溶液；

第三步，移取第二步稀释得到的各吲哚乙酸标准溶液于不同的反应管内，以等体积的蒸馏水作为空白，然后向吲哚乙酸标准液和空白中分别加入显色液，混匀，恒温显色反应20～40min后使混合液呈红色，用分光光度计测定吲哚乙酸标准液的吸光值，以吲哚乙酸的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制吲哚乙酸标准曲线；

第四步，移取第一步中的样品提取液于反应管内，以与样品提取液等体积的pH=6.1磷酸缓冲液为对照，向样品提取液和对照中分别加入混合反应试剂，混匀，恒温酶促反应20～40min，得到样品酶促反应液和对照反应液；

第五步，移取第四步中的样品酶促反应液和对照反应液于反应管内，以蒸馏水为空白，分别加入显色液，混匀，恒温反应20～40min使反应液呈红色，用分光光度计测定各反应液的吸光值，根据第三步中绘制的吲哚乙酸标准曲线得到样品酶促反应液和对照反应液中吲哚乙酸的浓度，再利用下述公式计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性：

样品中吲哚乙酸氧化酶的活性（µmol/g/h）=（C_对照－C_样品）×V_T×V/（W×t×V₁×M）；

式中，C_对照是对照反应液中吲哚乙酸的浓度，µg/mL；C_样品是样品酶促反应液中吲哚乙酸的浓度，µg/mL；V_T为第一步中样品提取液的总体积，mL；V为第四步中反应提取液与混合反应试剂的总体积，mL；W为平菇样品的重量，g；V₁为第四步中参加酶促反应的样品提取液体积，mL；t为第四步中酶促反应时间，h；M为吲哚乙酸的摩尔质量，175.18µg/µmol。

2.根据权利要求1所述的测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，其特征在于：所述第二步中吲哚乙酸母液的浓度为100μg/mL，所述吲哚乙酸标准液的浓度梯度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL和25μg/mL。

3.根据权利要求1所述的测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，其特征在于：所述第三步和第五步中的显色液均为由浓度为0.5M的FeCl₃和35%高氯酸按照1:50的体积比配制而成的混合液。

4.根据权利要求1所述的测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，其特征在于：所述第四步中的混合反应试剂为由1mL MnCl₂、1mL 2,4-二氯酚、2mL IAA溶液和5mL、pH=6.1的磷酸缓冲液组成的混合液，其中MnCl₂的浓度为1.0mM，2,4-二氯酚的浓度为1.0mM，IAA溶液的浓度为200μg/mL，磷酸缓冲液的浓度为0.02 M。