[发明专利]大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因及其克隆方法和应用

说明书

大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因及其克隆方法和应用，属于分子生物学和生物领域。本发明中，大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸和双氨基酸置换后的基因序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸和双氨基酸置换后的基因序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。上述获得的基因均衍生于大豆内源GmEPSPS1和GmEPSPS2基因，具有更强的草甘膦抗性能力，在生物安全性及利用基因工程技术手段创制抗草甘膦大豆新品系应用上具有广泛的社会和经济效益。

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因及其克隆方法和应用。

背景技术

大豆是我国重要的粮食和油料作物，在我国粮食产业中占据着非常重要的地位。目前，我国大豆生产的增长速度远不能满足我国人民的生活需求，需要依靠进口国际市场的转基因大豆。

田间杂草生长过盛是导致大豆作物减产的主要原因之一。除草剂草甘膦凭借其低毒、高效、广谱的除草优势占据着除草剂市场的主导地位。其作用机制主要是抑制莽草酸途径中的EPSPS酶，草甘膦与PEP竞争性结合EPSPS酶活性位点，使芳香族氨基酸合成受阻，进而使植物生长所需的生长激素、木质素等营养物质的合成也会受阻，进而导致植物死亡。EPSPS酶一般被分为两种类型，类型I主要来源于植物，大肠杆菌等部分微生物，对除草剂草甘膦的耐受性较低。类型II来源于覆盆子土壤杆菌、无色杆菌、假单胞菌等一些可以耐受极端环境影响的菌株，一般对草甘膦具有较高的耐受性。目前，国际上推广的抗草甘膦转基因大豆主要是利用基因工程手段过表达微生物来源的II型EPSPS基因的转基因大豆，其食品安全性备受争议。挖掘大豆内源的抗草甘膦基因，对利用基因工程手段培育安全性较高的抗除草剂大豆新种质，具有重要意义。

根据氨基酸序列同源比对分析结果表明，不同植物物种中，EPSPS酶具有保守的氨基酸序列区域“LGNAGTAMRPLTAA”，据报道，这个保守的区域可能是草甘膦与PEP竞争性结合EPSPS酶的活性位点。然而，大豆中EPSPS酶保守区“LGNAGTAMRPLTAA”发生突变修饰后对草甘膦抗性能力的影响并没有被公开报道过。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因及其克隆方法和应用。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因，它是大豆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸置换和双氨基酸置换后获得的基因；所述大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS1(PS)基因，其序列如SEQ ID NO.2所示，所述大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守区发生定向双氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS1(TIPS)基因，其序列如SEQ ID NO.3所示；所述大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS2(PS)基因，其序列如SEQ ID NO.5所示，所述大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区发生定向双氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS2(TIPS)基因，其序列如SEQ ID NO.6所示。

作为优选的实施方式，所述大豆GmEPSPS1基因和大豆GmEPSPS2基因为大豆吉育72中两个编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因。

作为优选的实施方式，所述大豆GmEPSPS1基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述大豆GmEPSPS2基因序列如SEQ ID NO.4所示。