[发明专利]柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白及其制备方法和应用。该蛋白是新发现的、柔嫩艾美耳球虫各发育阶段均高表达的蛋白。该蛋白氨基酸序列包含编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。将EtM2AP基因插入大肠杆菌表达载体pET28a获重组表达载体，转入大肠杆菌中表达鸡柔嫩艾美耳球虫重组蛋白(EtM2AP)，将该重组蛋白纯化并与佐剂混合，制得EtM2AP重组蛋白疫苗，该疫苗能有效提高雏鸡存活率和相对增重率，并能够减少免疫后雏鸡的球虫卵囊排出量，具有良好免疫保护效果的重组蛋白疫苗，有作为预防鸡柔嫩艾美耳球虫病疫苗的潜力。

技术领域

本发明是关于生物兽药技术领域，特别是关于一种柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

鸡球虫病是一种以肠道病变为主的寄生原虫病，是集约化养鸡场最常见的疾病之一，呈世界性分布。鸡球虫病的发病率高达50％～70％，死亡率为20％～30％，严重时高达80％，鸡球虫病是养鸡业必防的疾病之一，给养鸡业带来巨大经济损失，主要包括防治费用和生产性能下降(比如饲料转化率低，生长缓慢，死亡)造成的损失，美国农业部将该病列为对禽类危害最严重的五大疾病之一。世界公认的鸡球虫有7种，其中寄生于盲肠中的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)致病性最强，危害最严重，常常引起急性球虫病。

目前，球虫病的防控主要是依靠抗球虫药物和活疫苗，但由于球虫耐药性、药物残留和环境毒性等问题，抗球虫药物的使用受到了很大限制。已经商品化的球虫苗主要包括田间分离虫株研制的强毒苗(如Coccivac)和早熟选育的弱毒苗(如)，具有较好的免疫保护力，但同时存在保存期短、运输和储存条件高、应用后管理要求高、易导致免疫不均衡以及诱发球虫病等安全隐患。而且，这两类球虫苗的生产均必须在鸡体内进行，致使生产成本较高，价格较高。因此，研究者一直致力于亚单位疫苗的研发，但迄今为止，仅有球虫疫苗上市，该疫苗是由巨型艾美耳球虫配子体的天然蛋白制备而成，主要成分是天然提取的巨型艾美耳球虫的配子体蛋白EmGAM56、EmGAM82和EmGAM230，主要用于免疫母鸡，旨在使雏鸡具备较好的母源免疫。但主要从球虫卵囊的配子体阶段提取天然蛋白制备而成，存在抗原提取纯化工艺复杂，抗原来源不稳定，生产成本高，难以标准化等问题，所以未得到广泛应用。近年来，应用基因工程技术构建的重组蛋白疫苗证实可以诱导宿主产生较强的免疫保护力，一定程度地抵抗鸡球虫感染。重组蛋白疫苗与强毒苗、弱毒苗以及天然蛋白疫苗相比，具有安全性高、稳定性好、纯度高、易于制备以及产量高等优点，成为疫苗研发的新方向。

近年来，已经有多种柔嫩艾美耳球虫的保护性抗原见诸研究报道，如柔嫩艾美耳球虫IMP1和CD40 L重组蛋白免疫鸡后，被免疫鸡只产生较好的体液和细胞免疫应答，盲肠病变记分和增重均优于对照组；重组的柔嫩艾美耳球虫的RHO1蛋白免疫鸡后，被免疫鸡的IL–2和IFN-γ的表达水平以及CD4⁺、CD8⁺T 细胞的比例显著高于未免疫组，攻虫后免疫组的保护效率达到77.3％；用重组蛋白rEF-1α免疫雏鸡后，攻击柔嫩艾美耳球虫后雏鸡的卵囊排出量减少70％左右。此外，多位研究者分别报道了柔嫩艾美耳球虫的TA4、SO7、3-1E、SAG、HSP70、MIC1、MIC2和5401等一系列重组蛋白作为免疫抗原的研究，有着不同程度的免疫保护效果，但大多数重组蛋白的保护效果有限，主要原因是它们的免疫原性低或在虫体生命周期中的表达受限。已有的研究显示，不同抗原虽然能够诱发宿主一定程度上免疫反应，具有一定的抗球虫作用，但作为预防鸡球虫病的疫苗尚有一定的局限性，因此尚没有商品化的鸡球虫病重组蛋白疫苗应用于生产，需要进一步筛选有效的免疫保护抗原，为研制鸡球虫病重组蛋白疫苗奠定基础。

柔嫩艾美耳球虫有棒状体、微线体和致密颗粒三种特殊分泌细胞器，其中微线体蛋白2相关蛋白(MIC2-associated protein M2AP)是由微线体分泌的，在虫体运动、黏附和入侵过程中发挥关键作用。因此，筛选该蛋白并对其免疫保护效果进行评价，将对鸡球虫病重组蛋白疫苗的应用具有重大意义。