[发明专利]一种T-reg细胞的体外培养方法

说明书

本发明公开了一种T‑reg细胞的体外培养方法，包括肝素抗凝常规采血、分离外周血淋巴细胞血、分离原始CD4+T细胞、原始CD4+T细胞培养、诱导原始CD4+T细胞、调节性T细胞扩增。本发明的有益效果是：利用特殊成分的培养基，不需要像传统扩増Treg的方法那样需要多个周期的培养，诱导的Treg表型和调节功能稳定，而且极大降低了由于长期体外培养可能出现的细胞活力减弱、微生物污染等事件的发生率，对培养后的原始CD4+T细胞采用雷帕霉素联合TGF‑P通过Rapamycin联合TGF・B激活T细胞受体的信号通路在体外进行诱导，使之成为具有免疫抑制功能的调节性T细胞，且能够达到増加Foxp3的转录，进而促进调节T细胞的生成。

技术领域

本发明涉及一种T-reg细胞培养，具体为一种T-reg细胞的体外培养方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

系统性红斑狼疮作为一种典型的系统性自身免疫性疾病，主要表现为对自身抗原的外周免疫耐受失衡:T细胞过度活化増殖、B细胞功能亢进而引发的大量自身抗体产生，进而导致促炎因素和抗炎因素稳态遭受破坏，大量免疫复合物沉积，多器官多系统组织遭受炎症损害，近年来SLE的诊治水平取得了长足的进步，患者的生存率和狼疮育龄妇女安全生育率也明显提高，这得益于医学研究的不断深入和生物工程的发展。

细胞疗法作为其中一种治疗策略，巳经研究了数十年，其分支如干细胞治疗、免疫细胞治疗等的临床运用将越来越广泛。目前运用于临床的细胞疗法如骨髓造血干细胞移植、充质干细胞移植等已被证实是安全有效的治疗手段。

免疫调节细胞因具有维持机体的中枢和外周免疫耐受的特性而备受国内外学者的青睐，大量证据表明免疫调节细胞在预防自身免疫反应，减轻诸如感染、肿瘤、器官移植等因素造成的炎症反应和维持免疫稳态等方面均具有重要的作用，故基于调节细胞的治疗将有助于机体免疫耐受重建，最终SLE乃至自身免疫性疾病患者将能达到真正“痊愈”。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种T-reg细胞的体外培养方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种T-reg细胞的体外培养方法，包括以下步骤：

步骤一、肝素抗凝常规采血，在采血管内添加有肝素，并进行抽血采集；

步骤二、分离外周血淋巴细胞血，从采集到的血液中通过离心分离出外周血淋巴细胞；

步骤三、分离原始CD4+T细胞，由外周血淋巴细胞分离得到原始CD4+T细胞；

步骤四、原始CD4+T细胞培养，将获得的原始CD4+T细胞放入培养基中进行培养；

步骤五、诱导原始CD4+T细胞，对培养后的原始CD4+T细胞进行刺激和诱导，以得到调节性T细胞；

步骤六、调节性T细胞扩增，将所获得的调节性T细胞放置在细胞培养板上，对调节性T细胞进行扩增培养。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中，培养原始CD4+T细胞时，原始CD4+T细胞置于培养基置于37℃±5℃、5%±1%CO2的条件下，且培养7-10天。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中，培养原始CD4+T细胞所使用的培养基由完全RPMI-1640培养基中添加青穹素100U/ml、链霉素lOOug/ml、2mM左旋谷氨酸、10mM4-控乙基職嗪乙磺酸、O.lmM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和50HM二性基乙醇配制而成。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，对培养后的原始CD4+T细胞采用雷帕霉素联合TGF-P通过Rapamycin联合TGF・B激活T细胞受体的信号通路在体外进行诱导。