[发明专利]一种苦豆子SaENO2基因的克隆及应用

说明书

一种苦豆子SaENO2基因的克隆及应用属基因工程技术领域，本发明从苦豆子酵母表达文库中通过模拟逆境胁迫筛选出与抗盐碱相关的苦豆子基因，通过生物信息学分析确定其为苦豆子烯醇化酶2基因SaENO2，利用RT‑PCR技术进行定量检测发现该基因在苦豆子的根、茎、叶片中均有表达，其中在茎中表达量最高，且在碱处理条件下，茎中表达量明显提高。将该基因通过构建酵母表达载体和植物表达载体并成功转化酵母BY4743和拟南芥中进行功能验证，结果表明该基因在酵母和拟南芥中过表达后能够明显提高其耐盐碱性和耐旱性，这为通过基因工程技术提高作物的抗逆性提供了新的资源。

技术领域

本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种苦豆子烯醇化酶2基因的获取、构建含有编码基因的重组载体在酵母菌BY4743中进行耐逆性功能验证、构建植物过表达重组载体在拟南芥中进行耐逆性功能验证、同时利用实时荧光定量PCR（实时PCR，Real-Time-PCR，）的方法来研究该基因在非生物胁迫NaCl、NaHCO₃和PEG处理条件下的功能。

背景技术

植物在自然界中不断受到多重压力的挑战。在各种逆境压力中，盐碱胁迫是严重制约植物生长发育的非生物胁迫之一，也是制约农作物生产和生态环境建设的因素之一。目前，随着土壤盐碱化的加剧以及耕地面积的日益减少，这对于农作物的产量和质量具有严重的影响。盐碱度极大地限制了半干旱和干旱地区的作物产量。世界上有8.31亿 公顷的土壤受到过高盐碱度的影响。其中，碱土（碱性）为4.34亿公顷 ，盐碱土为3.97亿公顷。土壤盐分主要归因于NaCl的积累，而碱土则主要归因于NaHCO₃和Na₂CO₃的积累。预计到2050年，50%以上的耕地会发生盐碱化，严重威胁着土地利用率和作物产量。中国盐碱地尤其是内陆盐碱地多是盐化和碱化混合，成分复杂且程度各异。盐化和碱化常常同时发生，这种现象在很多地区普遍存在。

随着科学技术的进步，盐碱地在技术改良方面已经取得了很多成果。但是，受地域、资源、成本等限制，盐碱地的改良工作尚不完善。因而，培育耐盐碱品种的植物，提高植物的耐盐碱能力是缓解盐碱地对植物影响的一个有效生物措施，同时还可以产生较好的生态和经济效益，促进农业的可持续发展。因此，关于植物适应盐碱逆境的研究已成为国内外专家学者们当前研究中的一个热点

苦豆子( Sophora alopecuroides. L) 为豆科槐属植物，别名、苦豆草、苦甘草等，为多年生草本、根茎地下芽旱生耐盐植物。其耐旱、耐盐碱性显著，是一个抗性基因丰富的基因资源库。因此，从苦豆子中筛选克隆盐胁迫相关基因，分析其耐盐性，阐明其相关功能，有助于对抗盐基因的进一步利用。

烯醇化酶2（Enolase2,简称ENO2）是双功能酶，除了作为糖酵解酶，参与糖的分解代谢外，还具有转录因子的功能。烯醇化酶( Enolase, ENO, 2-phospho-D-glyceratehydrolyase)又称为2-磷酸-D-甘油酸盐水解酶，能够催化2-磷酸-D-甘油酸 (2-PGA) 向磷酸-烯醇式丙酮酸(PEP) 的转化，是糖酵解途径中唯一的脱水步骤，又可在糖质异生过程中催化逆向反应，即可作为磷酸丙酮酸盐水合酶催化PEP向PGA的转化过程。烯醇化酶不仅在生物体内普遍存在，而且还是许多生物体中表达最为丰富的细胞质蛋白之一。

植物 ENO 也包含三种同工酶，分别是 ENO1、ENO2 及 ENO3，其氨基酸序列是高度保守的，都包含一个典型的烯醇化酶 N 端区域和一个高度保守的 DNA 结合区域。植物ENO2 与动物的 α-ENO 同源性最高，而在植物中，拟南芥和水稻中的ENO2 同源性较高。ENO2 是在细胞质中发挥主要功能作用的烯醇化酶，在植物生长发育过程中高表达，其表达量是 ENO1 和 ENO3 的十倍左右。

在拟南芥，水稻等植物中，已观察到烯醇化酶在转录、转录后和翻译后水平上应答高盐、低温、缺氧等非生物胁迫，推测烯醇化酶可能在植物非生物胁迫应答中发挥重要作用。