[发明专利]酰胺酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用

说明书

本发明公开了一种酰胺酶突变体及其在催化合成2‑氯烟酸中的应用，属于酶工程技术领域。所述酰胺酶突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第378位、402位或403位进行单位点突变或多位点突变获得。本发明提供的酰胺酶突变体较亲本活力大幅提高，在使用该酶的粗提取物或工程菌全细胞进行催化时，反应酶活仍然保持较高状态。此外，本发明的酰胺酶突变体能够适应30～55℃的催化温度，为工业化酶法生产2‑氯烟酸奠定了基础。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种酰胺酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用。

背景技术

2-氯烟酸是一种合成农药和医药的重要中间体化合物。在农药领域，2-氯烟酸可用于合成磺酰脲类除草剂烟嘧磺隆、酰胺类除草剂吡氟草胺、酰胺类杀菌剂啶酰菌胺以及三唑硫酮类的一系列杀菌活性化合物等；在医药领域，2-氯烟酸是合成抗艾滋病药物-奈韦拉平、抗抑郁药物-米氮平、非甾体消炎镇痛药-尼氟灭酸、普拉洛芬以及烟甲灭酸等的重要中间体。由于2-氯烟酸在农药和医药中的广泛应用，其市场需求日益增长。

目前，2-氯烟酸的生产方法主要为化学合成法。如以烟酸为起始原料经氮氧化、氯化和水解合成2-氯烟酸；以3-氰基吡啶为原料，经氮氧化、氯化、水解合成2-氯烟酸；2-氯-3-甲基吡啶氧化法；以氰基乙酸乙酯为起始原料的成环法；以2-氯-3-三氟甲基吡啶为起始原料的氯化水解法。

自瑞士Lonza公司于1977年申请了2-氯烟酸合成专利后(US4144238)，日本有机合成和日本光荣化学等化工巨头先后投身于2-氯烟酸的合成研究(JP59144759；JP56169672)。目前工业上主要采用3-氰基吡啶法生产2-氯烟酸，但其生产工艺存在污染重、合成步骤冗长、收率低等缺陷。

酰胺酶是一类催化酰胺化合物合成相应羧酸的水解酶。因其高立体选择性、广底物谱等优势，以酰胺酶为生物催化剂的(手性)羧酸、(手性)酰胺衍生物及光学纯氨基酸的生物合成日益受到研究者的重视。酰胺酶法水解2-氯烟酰胺已成为合成2-氯烟酸的重要方法(CN101857889；Bioorganic Chemistry,2018,76:81-87)。

蛋白质工程和晶体结构解析等技术的发展为酶分子改造提供了强有力工具。在已报道的酰胺酶中，郑仁朝等构建的泛生菌来源酰胺酶Pa-Ami突变体G175A可高效催化2-氯烟酰胺合成2-氯烟酸(CN201710974605.4)。

构建高催化活力的酰胺酶生物催化剂对于实现2-氯烟酸的高效、绿色生产具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于通过定点饱和突变技术对泛生菌来源(Pantoea sp.)酰胺酶Pa-Ami突变体G175A进行进一步分子改造，提供一种突变体蛋白，提高其对2-氯烟酰胺的水解活力，从而有利于该酰胺酶在2-氯烟酸制备中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明在泛生菌来源酰胺酶Pa-Ami突变体G175A(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)基础上，利用半理性设计方法进一步获得酶活提高的突变体。所述酰胺酶突变体由SEQID NO.1所示氨基酸序列的第378位、402位或403位进行单位点突变或多位点突变获得。

具体的，所述的单位点突变为：将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第378位的丙氨酸(A)替换为缬氨酸(V)或苏氨酸(T)；或将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第402位的缬氨酸(V)替换为亮氨酸(L)；或将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第403位的亮氨酸(L)替换为缬氨酸(V)或苏氨酸(T)。